郭文敏，鄭利剛，邢 浩，白曉雪[.石藥集團(tuán)中奇制藥技術(shù)（石家莊）有限公司，石家莊 050035；.石家莊職業(yè)技術(shù)學(xué)院，石家莊 05008]

帕羅醇有2個(gè)手性中心，共有4個(gè)光學(xué)異構(gòu)體，反式左旋帕羅醇是帕羅西汀合成中的關(guān)鍵手性起始原料；而根據(jù)開發(fā)立體異構(gòu)體新藥的技術(shù)要求[1]，需要對手性起始原料的所有光學(xué)異構(gòu)體進(jìn)行嚴(yán)格控制，以確保終產(chǎn)品藥物的安全性、有效性、質(zhì)量可控性。文獻(xiàn)[2]中報(bào)道的方法只能檢測順式與反式2對非對映異構(gòu)體，不能同時(shí)檢測帕羅醇中可能存在的4個(gè)光學(xué)異構(gòu)體（A反式左旋帕羅醇、B反式右旋帕羅醇、C順式右旋帕羅醇、D順式左旋帕羅醇），因而有必要首先建立一套適合的分析方法對A的3種光學(xué)異構(gòu)體雜質(zhì)進(jìn)行有效控制。為此，本研究建立了同時(shí)測定帕羅醇中4種光學(xué)異構(gòu)體的含量方法，報(bào)道如下。

1 材料

1.1 儀器

UV-2201紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；1200高效液相色譜（HPLC）儀（美國Agilent公司）。

1.2 藥品與試劑

帕羅醇4種異構(gòu)體對照品（包括A、B、C、D，批號(hào)分別為：111201、111202、111203、111204，純度分別為：97.68%、97.19%、98.66%、96.39%）均為石藥集團(tuán)中奇制藥技術(shù)（石家莊）有限公司拆分、精制、標(biāo)定；A原料藥[石藥集團(tuán)中奇制藥技術(shù)（石家莊）有限公司自制，批號(hào)：120101、120102、120103，含量：99.56%、99.69%、99.91%]；正己烷、異丙醇均為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

對照品溶液：分別精密稱取A、B、C、D 4種異構(gòu)體對照品各10.0 mg，各置于100 ml量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為100 μg/ml的對照品溶液；將4種異構(gòu)體對照品溶液按1∶1∶1∶1混合，即得4種異構(gòu)體的混合對照溶液。

供試品溶液：分別精密稱取3批A原料藥各10.0 mg，分別置于100 ml量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.2 測定波長的選擇

分別以流動(dòng)相為溶劑將A、B、C、D 4種異構(gòu)體對照品配制成一定質(zhì)量濃度的溶液，在190～400 nm波長內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果表明，各異構(gòu)體在267 nm波長處均有較強(qiáng)的吸收，故選擇其作為檢測波長。

2.3 色譜條件

色譜柱為CHIRALPAK?IC-3（250 mm×4.6 mm，5 μm），以硅膠表面共價(jià)鍵合有纖維素-三（3，5-二氯苯基氨基）甲酸酯為填料；流動(dòng)相為正己烷-異丙醇-二乙胺（65∶35∶0.1），流速為1.0 ml/min；檢測波長為267 nm；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量為10 μl。

2.4 方法專屬性考察

分別精密量取A、B、C、D 4種異構(gòu)體的對照品溶液及其混合對照溶液各10 μl，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，A、B、C、D的保留時(shí)間分別為6.856、7.635、14.103、28.319 min，理論板數(shù)分別為12696、8186、9295、8029，兩兩間分離度分別為2.1、3.6、5.1，拖尾因子均小于1.15，空白溶劑不干擾測定。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.5 線性關(guān)系試驗(yàn)

分別精密稱取4種異構(gòu)體A、B、C、D對照品各適量，用流動(dòng)相依次稀釋制成含每個(gè)手性單體質(zhì)量濃度約為5.0、10、20、50、80、100、120 μg/ml的溶液，進(jìn)樣測定，以峰面積（A）對質(zhì)量濃度（c）進(jìn)行線性回歸，得4種異構(gòu)體的線性方程，見表1，結(jié)果表明4種異構(gòu)體檢測質(zhì)量濃度線性范圍均為5～120 μg/ml。

2.6 檢測限試驗(yàn)

取上述對照品溶液，逐級稀釋至信噪比≥3時(shí)，4種異構(gòu)體的檢測限均為10 ng。

2.7 回收率試驗(yàn)

按“2.1”項(xiàng)下方法稱取已知4種異構(gòu)體含量的供試品各9份，分別加入含4種異構(gòu)體為高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度的對照品溶液各3份，進(jìn)樣測定，計(jì)算各個(gè)異構(gòu)體的回收率。4種異構(gòu)體A、B、C、D的回收率試驗(yàn)結(jié)果見表2。

2.8 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別取各異構(gòu)體對照品溶液于室溫下放置，于0、2、4、6、8 h進(jìn)樣測定。結(jié)果各異構(gòu)體的峰面積在8 h內(nèi)RSD均小于0.4%（n＝5），表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取批號(hào)為120101的樣品6份，分別配制成供試品溶液，進(jìn)樣測定，結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好，詳見表3。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果（%%，n＝3）Tab 2Results of recovery test（%%，n＝3）

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（%%，n＝6）Tab 3Results of repeatability test（%%，n＝6）

2.10 樣品中異構(gòu)體含量測定

分別稱取3批樣品配制成供試品溶液后進(jìn)樣測定，結(jié)果見表4，色譜見圖1⑥（批號(hào)：120103）。

表4 3批樣品中異構(gòu)體含量測定結(jié)果（%%）Tab 4 Results of content determination of enantiomers in 3 batches of samples（%%）

3 討論

3.1 色譜柱的選擇

本研究前期試驗(yàn)中分別以蛋白質(zhì)型、多糖衍生物型、硅膠表面共價(jià)鍵合有纖維素-三（3，5-二氯苯基氨基）甲酸酯等為填料的手性色譜柱進(jìn)行4種異構(gòu)體檢測方法的摸索。結(jié)果表明，以蛋白質(zhì)型為填料的色譜柱的色譜峰形較差，無法有效分離4種手性異構(gòu)體；以多糖衍生物型為填料的色譜柱雖然能夠分離4種異構(gòu)體，但要異構(gòu)體A和B達(dá)到分離度大于1.5以上的理想分離，異構(gòu)體D的保留時(shí)間將在90 min以上，且柱效較差，不適合含量測定使用。故本研究最終選擇了以硅膠表面共價(jià)鍵合有纖維素-三（3，5-二氯苯基氨基）甲酸酯為填料的色譜柱，結(jié)果4種異構(gòu)體均達(dá)到基線分離，分析時(shí)間為30 min，4種手性異構(gòu)體色譜峰的理論板數(shù)均在8000以上，適合于快速、準(zhǔn)確測定4種異構(gòu)體含量的要求。

3.2 流動(dòng)相的選擇

以硅膠表面共價(jià)鍵合有纖維素-三（3，5-二氯苯基氨基）甲酸酯為填料的色譜柱，選用正己烷-異丙醇為流動(dòng)相時(shí)，由于帕羅醇為含醇羥基的化合物，故在流動(dòng)相中加入堿性改性劑二乙胺可以顯著地改善色譜峰的保留行為、分離度及柱效。通過對正己烷-異丙醇-二乙胺比例分別為66∶34∶0.1、65∶35∶0.1、64∶36∶0.1的流動(dòng)相進(jìn)行篩選，最終選擇以正己烷-異丙醇-二乙胺（65∶35∶0.1）為流動(dòng)相。試驗(yàn)表明此流動(dòng)相下4種異構(gòu)體在較短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到基線分離。

本研究另對流速及柱溫進(jìn)行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)流速的改變對異構(gòu)體的分離影響不大，為減少分析運(yùn)行時(shí)間，選擇流速為1.0 ml/min；柱溫由15℃升高到40℃，雖然保留時(shí)間由60 min減少到35 min，但異構(gòu)體A和B的分離度由2.9降低到1.45，綜合比較，選擇柱溫為25℃。

綜上，本研究經(jīng)采用不同手性色譜柱、不同流動(dòng)相體系、不同流動(dòng)相調(diào)節(jié)劑（二乙胺、三氟乙酸、甲酸等）對4種異構(gòu)體進(jìn)行色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，優(yōu)化確定了同時(shí)測定4種異構(gòu)體含量的準(zhǔn)確、快速的HPLC法條件。本研究成功地實(shí)現(xiàn)了對反式左旋帕羅醇光學(xué)異構(gòu)體（A）雜質(zhì)的有效控制，對提高用其作為原料合成的藥品帕羅西汀的安全性、有效性、質(zhì)量可控性具有促進(jìn)作用。

[1]黃曉龍.美國FDA關(guān)于開發(fā)立體異構(gòu)體新藥的政策簡介[J].中國新藥雜志，2000，9（9）：650.

[2]郭文敏，白曉雪，梁亞麗，等.HPLC法同時(shí)測定帕羅醇中反式帕羅醇和順式帕羅醇的含量[J].中國藥師，2011，14（11）：1570.