孫克康 仲 寧 沈曉軍 楊 棟 劉 剛 甘明強(qiáng) 吳曉陽

(昆山市第一人民醫(yī)院 江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院心胸胃腸外科，江蘇 昆山 215300)

結(jié)直腸癌發(fā)病率約占所有腫瘤的10% ～15%，手術(shù)治療是首選的治療方式〔1〕，但相當(dāng)一部分患者確診時(shí)已處于中晚期，因此化療、輔助化療成為結(jié)直腸癌重要的治療手段。順鉑作為重要的化療藥物在結(jié)直腸癌的化療中發(fā)揮重要的作用。ErbB2轉(zhuǎn)錄因子1(TOB1)基因是B細(xì)胞異位基因/erbB2轉(zhuǎn)錄因子(BTG/TOB1)抗增殖蛋白家族中研究最多的一個(gè)成員，大量的研究證實(shí)TOB1基因在抑制肺癌細(xì)胞惡性增殖、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的作用〔2～4〕。本實(shí)驗(yàn)研究順鉑對(duì)結(jié)直腸癌HCT-116細(xì)胞中TOB1表達(dá)的影響，為TOB1的抗癌研究及結(jié)直腸癌臨床化療療效判斷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT-116購自美國細(xì)胞收藏中心(American type culture collection)，由本室保藏。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、0.25%胰酶、胎牛血清購自美國Invitrogen公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Go Taq Green Master Mix PCR擴(kuò)增試劑盒購自美國Invitrogen公司，PCR反應(yīng)試劑盒購自美國Promega公司，PCR引物采用Premier5.0軟件設(shè)計(jì)，交由Invitrogen公司合成。實(shí)驗(yàn)所需其余試劑購自上海生物工程技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)采用含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)，每2 d換液1次，3 d傳代1次。

1.2.2 RT-PCR檢測(cè)TOB1對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控按Trizol試劑盒說明書提取總RNA，用DEPC水溶解RNA，紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定RNA純度(A260 nm/A280 nm＞1.80)。各取總RNA 5 μg，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行第一鏈cDNA合成(詳見逆轉(zhuǎn)錄試劑盒參考說明)。PCR所需引物序列見表1，反應(yīng)條件參見文獻(xiàn)〔5〕。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀上觀察、拍照。通過quantity one圖像分析軟件對(duì)各條帶灰度進(jìn)行檢測(cè)，以內(nèi)參GAPDH的灰度為標(biāo)準(zhǔn)，各組mRNA的灰度值與之相比。

表1 RT-PCR實(shí)驗(yàn)所需的引物名稱及序列

1.2.3 Western印跡法檢測(cè)TOB1對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)控 收集細(xì)胞，IP裂解液裂解，離心收集蛋白樣品，BCA法測(cè)定蛋白濃度。每組樣品取50 μg總蛋白采用10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，室溫下以5%脫脂奶粉進(jìn)行非特異性的抗原封閉1 h，隨后加入特異性一抗溶液室溫作用1 h，0.1%Tween PBS洗滌后與HRP耦聯(lián)的二抗溶液室溫作用1 h，洗滌后采用化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒進(jìn)行曝光，同一張膜測(cè)定β-actin蛋白作為樣品內(nèi)參?？筎OB1(N-20)單克隆抗體稀釋倍數(shù)1∶200，抗-Actin(C4)單克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG、驢抗羊IgG的稀釋倍數(shù)均為1∶1 000。通過quantity one圖像分析軟件對(duì)各條帶灰度進(jìn)行檢測(cè)，以內(nèi)參-Actin的灰度為標(biāo)準(zhǔn)，各組蛋白的灰度值與之相比。

1.2.4 免疫熒光 胰酶消化處于指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按照一定的數(shù)量接種在0.14 mm厚的玻璃培養(yǎng)皿，(直徑3.5 cm)，48 h用20 mol/L順鉑處理細(xì)胞，2 h后用 PBS洗3遍，每次5 min，4%多聚甲醛固定30 min，PBS 洗3 遍，每次5 min，0.2%曲拉通破膜30 min，PBS洗3遍，每次5 min，1%BSA 封閉，4℃避光過夜;加入TOB1一抗(1∶200)4℃避光過夜;PBS避光洗3遍，加入FITC標(biāo)記的兔抗鼠 IgG(1∶500)4°C避光1 h，PBS避光洗3遍，每次5 min，加入DAPI避光30 min，PBS避光洗3遍，每次5 min，加入防淬滅封閉液。采用激光共聚焦顯微鏡觀察488激光激發(fā)下綠色熒光。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和方差分析。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量順鉑對(duì)TOB1 mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響不同劑量順鉑處理后TOB1 mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比均明顯增加(P＜0.05)，并且TOB1的表達(dá)水平隨順鉑劑量增加呈逐漸增加趨勢(shì);不同劑量的順鉑處理后TOB1蛋白的表達(dá)水平比對(duì)照組明顯增加(P＜0.05)，同時(shí)TOB1蛋白表達(dá)水平隨順鉑劑量增加逐漸增加，見圖1。

2.2 順鉑處理后不同時(shí)間TOB1 mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化 20 μmol/L順鉑處理2 h后TOB1 mRNA表達(dá)水平即開始增加(P＜0.05)，照射24 h后仍保持較高的表達(dá)水平;順鉑處理2 h后TOB1蛋白的表達(dá)水平明顯增加(P＜0.05)，照射24 h后仍保持較高的表達(dá)水平，見圖2。

2.3 順鉑誘導(dǎo)HCT-116細(xì)胞中TOB1向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位 HCT-116細(xì)胞中TOB1主要分布在細(xì)胞質(zhì)，而20 μmol/L順鉑處理2 h后HCT-116細(xì)胞中TOB1主要分布在細(xì)胞核;說明順鉑處理后早期可誘導(dǎo)HCT-116細(xì)胞質(zhì)中TOB1向胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位，見圖3。

圖1 不同劑量順鉑對(duì)TOB1 mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響

圖2 順鉑處理后不同時(shí)間TOB1 mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化

圖3 順鉑對(duì)TOB1細(xì)胞內(nèi)分布的影響

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展以及腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過程，抑癌基因的失活在其中發(fā)揮著重要的作用。目前結(jié)直腸癌的早期診斷率還比較低，大多數(shù)患者在確診時(shí)已屬中晚期，且手術(shù)后的患者中仍有50%以上會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移?；熓侵委熗砥诨驈?fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌的主要手段，多年來順鉑是治療結(jié)直腸癌最主要的化療藥物之一。近年來，由于分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)結(jié)直腸癌分子機(jī)制的研究不斷深入，部分腫瘤標(biāo)志物及靶基因在治療前后表達(dá)水平的變化對(duì)判斷腫瘤短期療效及預(yù)后中有重要意義。

TOB1是1996年日本學(xué)者M(jìn)atsuda在篩選與erbB2相互作用的蛋白時(shí)首次發(fā)現(xiàn)，因此被命名為erbB2轉(zhuǎn)導(dǎo)因子1。TOB1基因定位于染色體17q21，編碼含345個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)分子〔6〕。由于TOB1基因在細(xì)胞靜止期和抗細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要的作用，其表達(dá)和功能的改變往往引起細(xì)胞的惡性進(jìn)展，因此成為腫瘤學(xué)研究新的熱點(diǎn)〔7〕。本研究證實(shí)了順鉑可以誘導(dǎo)結(jié)直腸癌HCT-116細(xì)胞中TOB1的表達(dá)，并可以誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)中TOB1向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位，提示TOB1具有作為臨床結(jié)直腸癌化療靶基因的可能，該基因的靶向研究可能對(duì)肺癌臨床化療療效的判斷具有一定的指導(dǎo)作用。

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