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        美洛昔康對(duì)慢性鋁過(guò)負(fù)荷致神經(jīng)元退變大鼠腦內(nèi)金屬離子含量的影響

        2014-12-03 08:33:34楊俊卿南充市中心醫(yī)院藥學(xué)部四川南充637000
        中國(guó)老年學(xué)雜志 2014年4期
        關(guān)鍵詞:洛昔康灌胃腦組織

        蘇 強(qiáng) 楊俊卿 唐 捷 (南充市中心醫(yī)院藥學(xué)部,四川 南充 637000)

        流行性病學(xué)調(diào)查研究結(jié)果提示,人類攝入鋁的途徑中95%主要來(lái)自于食物,而只有不到1%的量來(lái)自于空氣中粉塵鋁〔1〕。長(zhǎng)期飲用含鋁濃度較高的水,AD 發(fā)病率明顯升高〔2〕。長(zhǎng)期接觸大劑量的鋁可造成機(jī)體多個(gè)組織器官損害,并引起嚴(yán)重的CNS毒性,表現(xiàn)為行為認(rèn)知功能障礙、中樞神經(jīng)元損傷乃至神經(jīng)元退行性變,但其機(jī)制仍未徹底闡明。通過(guò)腦室給鋁,可使鋁異常沉積于腦皮層各區(qū)以及海馬,導(dǎo)致動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶功能的損害和神經(jīng)元退變〔3〕,但此腦損傷應(yīng)為急性損傷;同時(shí)腦室給鋁方式與臨床鋁經(jīng)口攝入途徑有很大差異,屬于有創(chuàng)性模型,因而有學(xué)者認(rèn)為其還不能稱為嚴(yán)格意義上的神經(jīng)元退變模型。因此,在本研究中采用大鼠長(zhǎng)期灌胃給予鋁鹽的方法建立神經(jīng)元退變動(dòng)物模型,并以此模型研究美洛昔康對(duì)慢性鋁過(guò)負(fù)荷致神經(jīng)元退變大鼠腦內(nèi)金屬離子含量的影響,期望從另一個(gè)視角探討慢性鋁過(guò)負(fù)荷致大鼠神經(jīng)元退變與腦內(nèi)金屬離子的關(guān)系。

        1 材料與方法

        1.1 動(dòng)物與主要試劑 清潔級(jí)雄性Wistar大鼠40只,質(zhì)量220~250 g,由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證書號(hào)SCXK(渝)20020003。六水三氯化鋁(國(guó)產(chǎn)分析純),葡萄糖酸鈉(國(guó)產(chǎn)分析純),等離子體原子發(fā)射光譜檢測(cè)(解放軍后勤工程學(xué)院進(jìn)行)。

        1.2 方法

        1.2.1 慢性鋁過(guò)負(fù)荷致神經(jīng)元退變大鼠模型的建立 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)條件下飼養(yǎng)3 d以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為4組,每組10只大鼠,即正常對(duì)照組、慢性鋁過(guò)負(fù)荷模型組、美洛昔康3 mg/kg組和美洛昔康1 mg/kg組。稱取17.9 g AlCl3·6 H2O及9.9 g葡萄糖酸鈉溶于一定量雙蒸水中,待溶液清澈后用0.1 mol/L NaOH將溶液滴定到pH 6.0左右,用雙蒸水定容至100 ml,配制成含Al3+20 g/L的葡萄糖酸鋁溶液,慢性鋁過(guò)負(fù)荷模型組大鼠灌胃給予葡萄糖酸鋁(Al3+200 mg·kg-1·d-1),每周5 d,連續(xù)20 w;正常對(duì)照組大鼠灌胃給予與藥物等體積的0.3%羧甲基纖維素鈉;美洛昔康1、3 mg/kg組在每次給予鋁鹽后30 min灌胃給予,每周灌胃5 d,連續(xù)20 w,灌胃體積為10 ml/kg。所有動(dòng)物有關(guān)的實(shí)驗(yàn)與操作均在學(xué)校道德與倫理委員會(huì)的指導(dǎo)和許可下進(jìn)行。在20 w模型制備過(guò)程中,鋁鹽毒性造成部分大鼠死亡。

        1.2.2 金屬離子測(cè)定 取-80℃冰箱保存的大鼠腦組織稱重,加入2 ml雙蒸水,勻漿,按8 ml/g腦濕重加入25%四乙基氫氧化銨溶液,80℃消化24 h至溶液澄清,加雙蒸水定容到10 ml,測(cè)定時(shí)用雙蒸水稀釋5倍。為了避免金屬離子的干擾,所有過(guò)程均采用一次性塑料試管。金屬離子含量采用等離子體原子發(fā)射光譜分光光度儀測(cè)定,用內(nèi)標(biāo)法直接測(cè)定,測(cè)定波長(zhǎng)分 別 為:鋁 309.3 nm,鐵 238.2 nm,銅 224.7 nm,鋅206.2 nm。

        2 結(jié)果

        慢性鋁過(guò)負(fù)荷模型組中金屬離子含量(鋁、鐵、銅、鋅)明顯高于正常對(duì)照組,與模型組相比,美洛昔康給予能明顯降低大鼠海馬中金屬離子含量,與美洛昔康1 mg/kg組相比,美洛昔康3 mg/kg組大鼠海馬中金屬離子含量降低更為明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05,P <0.01)。見表1。

        表1 美洛昔康對(duì)慢性鋁過(guò)負(fù)荷大鼠腦組織金屬離子含量的影響( s,n=3)

        表1 美洛昔康對(duì)慢性鋁過(guò)負(fù)荷大鼠腦組織金屬離子含量的影響( s,n=3)

        與對(duì)照組比較:1)P <0.05;與模型組比較:2)P <0.05,3)P <0.01;與美洛昔康小劑量組比較:4)P <0.05

        組別 鋁(μg/g)鐵(μg/g)銅(μg/g)鋅(μg/g)21.53 ±2.90 31.09 ±1.87 3.37 ±0.99 3.92 ±0.73鋁鹽模型組 61.17 ±9.251) 88.97 ±13.981) 10.09 ±0.921) 9.77 ±0.941)美洛昔康大劑量組 41.68 ±1.152)4) 43.32 ±2.852)4) 6.42 ±0.883) 6.37 ±0.453)4)美洛昔康小劑量組 46.46 ±2.242) 56.57 ±4.502) 7.65 ±0.452) 7.39 ±0.252)空白對(duì)照組

        3 討論

        眾所周知鋁具有明顯的神經(jīng)毒性,鑒于鋁中毒涉及學(xué)習(xí)記憶障礙和有文獻(xiàn)報(bào)道AD患者腦內(nèi)鐵代謝失衡〔4〕,人們推測(cè)鋁的神經(jīng)毒作用可能與影響腦鐵的代謝有關(guān),但這種關(guān)系缺乏有力的直接證據(jù)。

        在本實(shí)驗(yàn)研究中,筆者采用長(zhǎng)期灌胃給鋁的方法建立了神經(jīng)元退變大鼠模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組大鼠相比,慢性鋁過(guò)負(fù)荷大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力明顯損害,同時(shí),大鼠兩側(cè)海馬出現(xiàn)明顯的核固縮,細(xì)胞層次明顯減少,這與腦室給予鋁鹽、一氧化碳中毒等致腦損傷的海馬形態(tài)學(xué)改變特點(diǎn)相似〔5〕。結(jié)合大鼠行為學(xué)、病理學(xué)變化,筆者認(rèn)為本研究中長(zhǎng)期灌胃給予葡萄糖酸鋁,可以導(dǎo)致大鼠神經(jīng)元退變,而與腦室給鋁模型相比,更能模擬臨床攝入鋁致人神經(jīng)毒性的方式。

        研究發(fā)現(xiàn)鋁過(guò)負(fù)荷致神經(jīng)元退變與腦內(nèi)金屬離子水平關(guān)系非常密切。鐵是機(jī)體必需的一種重要微量元素,但是過(guò)量的鐵可通過(guò)Fenton反應(yīng)生成具有大量毒性極大的羥自由基,引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng),最終誘發(fā)神經(jīng)元退行性變〔6〕。其他金屬離子如銅、鋅是腦內(nèi)一些抗氧化性酶重要組成部分,如Cu-ZnSOD。何百成等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)腦室給鋁導(dǎo)致急性腦損傷,小鼠腦組織鐵、銅、鋅水平明顯增加。羅映等〔8〕等研究發(fā)現(xiàn)鋁過(guò)負(fù)荷可致小鼠腦組織Cu-ZnSOD活性先升高后下降,并認(rèn)為鋁過(guò)負(fù)荷引起腦氧化應(yīng)激反應(yīng),抗氧化應(yīng)激物質(zhì)如Cu-ZnSOD表達(dá)增加,但是SOD基因長(zhǎng)期受到自由基攻擊而出現(xiàn)突變,造成抗氧化應(yīng)激的酶功能下降,最終導(dǎo)致機(jī)體抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)失衡,加重?fù)p傷。

        與上述研究結(jié)果相似,筆者的研究發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照組相比,模型組海馬組織中金屬離子鋁、鐵、銅、鋅水平明顯增加;給予美洛昔康在阻遏鋁過(guò)負(fù)荷大鼠腦組織金屬離子水平的增加。關(guān)于美洛昔康阻遏金屬離子含量增加的機(jī)制,目前尚未完全揭示,有研究發(fā)現(xiàn),前列腺素以及白三烯可促進(jìn)血腦屏障的開放,從而加重腦缺血損傷〔9〕,通過(guò)筆者前期研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元退變能夠明顯誘導(dǎo)大鼠海馬COX-2 mRNA和蛋白表達(dá)增加〔10〕,增加前列腺素的產(chǎn)生,從而開放血腦屏障,大量金屬離子進(jìn)入腦內(nèi),使得腦內(nèi)金屬離子含量明顯增加;而美洛昔康作為COX-2選擇性抑制劑,能夠抑制COX-2 mRNA和蛋白表達(dá),減少前列腺素的產(chǎn)生,重新關(guān)閉血腦屏障,因而使得進(jìn)入腦內(nèi)的金屬離子含量明顯降低。筆者的研究還發(fā)現(xiàn),在腦內(nèi)鐵、鋁離子含量明顯高于其他金屬離子,而以鐵離子含量最高,這可能由于造模本身灌胃給予大量鋁離子,使得大量鋁離子在腦組織沉積,而鋁通過(guò)影響鐵調(diào)節(jié)蛋白2使細(xì)胞鐵蛋白表達(dá)明顯降低,最后致使鐵水平顯著升高〔11〕。

        總之,美洛昔康對(duì)慢性鋁過(guò)負(fù)荷致神經(jīng)元退變大鼠腦內(nèi)金屬離子含量升高有明顯的抑制作用。

        1 Jalil EC,F(xiàn)alcon AG,Cabrera MG,et al.Assessment of the relative contribution of COX-1 and COX-2 isoforms to ischemia induced oxidative damage and neurodegeneration following transient global cerebral ischemia〔J〕.J Neurochem,2003;86(3):545-8.

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        9 Stanimirovic D,Shapiro A,Wrong J,et al.The induction of ICAM-1 in human cerebromicrovascular endothelial ceils(HCEC)by ischemia-like conditions promotes enhanced neutrophil/HCEC adhesion〔J〕.J Neuroimmunol,1997;76(1-2):193-205.

        10 蘇 強(qiáng),楊俊卿,張 鵬.美洛昔康對(duì)慢性鋁超負(fù)荷致神經(jīng)元退變大鼠海馬環(huán)氧化酶2表達(dá)的影響〔J〕.中國(guó)藥理與毒理學(xué),2009;23(1):6-10.

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