夏 銘 潘 雪(貴陽中醫(yī)學院，貴陽 貴州 550002)

糖尿病是以糖代謝紊亂為主要表現(xiàn)的內(nèi)分泌疾病，源于糖的來源與去路失去了動態(tài)的平衡，導致胰腺功能障礙，胰島素分泌減少。胰島素由胰島β細胞合成和分泌，經(jīng)血循環(huán)到達體內(nèi)各組織器官的靶細胞，與特異受體結(jié)合并引發(fā)細胞內(nèi)物質(zhì)代謝效應(yīng)。關(guān)注胰島β細胞的保護和再生作用的研究成為目前糖尿病防治工作的重點方向。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 構(gòu)建生殖系穩(wěn)定整合目的基因的轉(zhuǎn)基因斑馬魚系F2代。進入北京愛生斑馬魚全自動養(yǎng)殖系統(tǒng)，按照Westerfield〔1〕方法喂養(yǎng)4 w后進行規(guī)律交配訓練，以質(zhì)量穩(wěn)定的胚胎作為實驗對象。

1.2 實驗試劑 限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、E.coli DH5α感受態(tài)、凝膠純化試劑盒、質(zhì)粒小規(guī)模抽提試劑盒購自Takra公司;In Situ Cell Death Detection Kit、DIG標記試劑盒購自Roche公司;SP6 RNA polymerase、T7 RNA polymerase、T3 RNA polymerase、RNA柱純化試劑盒購自Ambion公司;levamisol、甲硝唑購自Sigma公司。Western Blotting Chemiluminescence Luminol Reagent購自Santa Cruz公司。其他的常規(guī)生化及分子生物學試劑均購自上海生工生物工程公司。

1.3 主要實驗儀器 斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)(北京ESEN Environ Science)、生化培養(yǎng)箱(青島Hair)、梯度PCR儀和臺式冷凍離心機(德國Eppendorf)、多功能電泳儀及水平電泳槽和UVP凝膠成像儀(上海復日科技)、雜交爐(美國Boekel)、蔡斯體視熒光顯微鏡及顯微攝像系統(tǒng)(德國ZEISS Stereo Discovery.V20)。

1.4 全胚胎原位雜交(WISH)分別以構(gòu)建好的斑馬魚胰島素cDNA和GFP-PCS2+重組質(zhì)粒作為模版，體外轉(zhuǎn)錄合成地高辛標記的反義mRNA探針;收集固定INS-nfsB-tg系F2代轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎，脫水后復水化處理，分別以胰島素和綠色熒光蛋白(GFP)的mRNA探針于雜交緩沖液65℃雜交過夜。斑馬魚胚胎在封閉液中封閉1～3 h。然后加入抗地高辛抗體4℃處理過夜。之后用BCIP/NBT溶液處理胚胎30～60 min，顯微鏡下觀察顯色情況，然后用1 ml磷酸鹽緩沖液(PBST)3次快速漂洗終止顯色反應(yīng)。當熒光蛋白與內(nèi)源性胰島素表達共定位，可證實綠色熒光蛋白對胰島β細胞可靠的示蹤性。

1.5 Western印跡技術(shù) 取20個斑馬魚胚胎于1.5 ml Eppendorf管中，去卵黃囊緩沖液(55 mmol/L NaCl，1.8 mmol/L KCl，1.25 mmol/L NaHCO3)，分離斑馬魚胚胎的卵黃囊，反復清洗2次后加入RIPA裂解液和PMSF超聲裂解，酶標儀定量。取等量蛋白樣品加等體積的上樣緩沖液煮沸10 min，10%SDSPAGE電泳進行條帶分離，SDS-PAG凝膠上的蛋白在 Mini Trans-Blot Cell(BioRad)中電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(OPTITRAN BA-S，Schleicher＆ Schuell，Keene，NH，USA)。封閉液 4℃封閉過夜，加入一抗，室溫孵育1 h，PBST清洗后，加入二抗，室溫孵育1 h，按試劑說明書用Western Blotting Chemiluminescence Luminol Reagent進行化學發(fā)光顯影，并用X光片記錄影像。為了檢測活體熒光蛋白表達效率，通過Western印跡技術(shù)檢測內(nèi)源綠色蛋白的表達水平來測定甲硝唑破壞胰島β細胞的效率。

1.6 免疫熒光 收集胚胎用4%多聚甲醛4℃固定過夜。胚胎進行脫水和復水，-20℃的甲醇過夜。-20℃預冷丙酮處理10 min，PBST清洗胚胎，TritonX-100室溫透化30 min，阻滯液室溫封閉1 h，加入特異性一抗4℃孵育過夜，PBST室溫清洗3次后加入二抗，室溫孵育1 h，去除二抗，PBST清洗降低背景，Tunnel反應(yīng)液37℃孵育2 h，PBST清洗2次，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。采用全胚胎免疫熒光的方法檢測甲硝唑作用后綠色熒光蛋白表達效率明顯降低。同時運用TUNEL試劑盒檢測細胞凋亡情況。

2 結(jié)果

2.1 化學方法破壞胰島β細胞 通過顯微注射將轉(zhuǎn)基因構(gòu)件注入斑馬魚體內(nèi)，篩選并獲得可以穩(wěn)定遺傳的表達綠色熒光蛋白的胰島β細胞的F2代轉(zhuǎn)基因斑馬魚系(圖1a)。運用INS探針和GFP探針，通過全胚胎原位雜交實驗證實了綠色熒光蛋白與胰島β細胞表型共定位(圖1b)。Mt2孵育48 h后可見活體熒光蛋白表達量明顯降低，同時胚胎發(fā)育情況和甲硝唑?qū)ε咛サ亩拘詻]有明顯影響(圖1c)。

2.2 Western印跡技術(shù)證實胰島β細胞的破壞效果 熒光顯微鏡下選取甲硝唑化學破壞48 h后的胚胎，綠色熒光蛋白表達明顯減低的活體胚胎，熒光蛋白表達效率同時減低，且未在野生型組檢測到熒光蛋白的表達。該結(jié)果證實了甲硝唑確實能靶向破壞胰島β細胞，并能夠通過活體熒光觀察方便地識別(圖2)。

2.3 全胚胎免疫熒光檢測 甲硝唑組GFP熒光蛋白明顯降低同時，細胞的凋亡也比對照組明顯增多(圖3)。

圖1 化學方法破壞胰島β細胞

圖2 Western印跡技術(shù)檢測熒光蛋白表達效率

圖3 全胚胎免疫熒光檢測綠色熒光蛋白表達

3 討論

轉(zhuǎn)基因技術(shù)為人類疾病動物模型研究提供了一種新的方法〔2〕，通過人為改造動物基因組，能在活體水平上研究人類疾病基本發(fā)生的分子機制、組織病理狀況、治療的效果等，目前應(yīng)用于現(xiàn)代生物學的各個方面。

研究利用斑馬魚這一模式生物〔3〕，因其常年產(chǎn)卵，一次交配能獲得數(shù)百個胚胎，胚胎在體外受精，發(fā)育早期呈透明，易于操作，發(fā)育過程可被直接連續(xù)觀察，方便進行大規(guī)模的化學突變型篩選，定位克隆和活體候選藥物篩選等諸多優(yōu)勢。前期研究中，通過顯微注射的方法，將轉(zhuǎn)基因構(gòu)件整合至斑馬魚基因組中，構(gòu)建了特異性標記胰島β細胞為“綠色”細胞的胰島β細胞轉(zhuǎn)基因斑馬魚系。在轉(zhuǎn)基因斑馬魚的胚胎養(yǎng)殖水中加入甲硝唑，通過硝基還原酶還原甲硝唑的硝基成一種細胞毒成分〔4〕，既不影響胚胎發(fā)育，也不會引起胚胎過度畸形和大量死亡，同時隨著基因的表達，這種細胞毒性可以靶向性作用于細胞的DNA代謝過程，抑制細胞的脫氧核糖核酸的合成，干擾細胞的生長、繁殖，最終導致細胞死亡，獲得一種化學遺傳學破壞胰島β細胞的活體斑馬魚疾病模型。

不同類型糖尿病的病因不盡相同，胰島β細胞不同程度破壞的核心病機引起了廣泛關(guān)注。更多研究集中在保護、再生和移植胰島β細胞〔5，6〕，期望可以獲得糖尿病治療的有效方法。

1 Westerfield M.The zebrafish book:a guide for the laboratory use of Zebrafish(Danio rerio)〔M〕.Eugene:University of Oregon Press，1995:56-60.

2 Wadsworth JD，Asante EA，Collinge J.Contribution of transgenic models to understanding human prion disease〔J〕.Neuropathol Appl Neurobiol，2010;36(7):576-97.

3 Jorqens K，Hillebrands JL，Hammes HP，et al.Zebrafish:a model for understanding diabetic complications〔J〕.Exp Clin Endocrinol Diabetes，2012;120(4):186-7.

4 Pisharath H，Parsons MJ.Nitroreductase-mediated cell ablation in transgenic zebrafish embryos〔J〕.MethodsMol Biol，2009;546:133-43.

5 Stendahl JC，Kaufman DB，Stupp SI.Extracellular matrix in pancreatic islets:relevance to scaffold design and transplantation〔J〕.Cell Transplant，2009;18(1):1-12.

6 Cantarelli E，Citro A，Marzorati S，et al.Murine animal models for preclinical islet transplantation:no model fits all(research purposes)〔J〕.Islets，2013;5(2):79-86.