張 濤 遲雁青 李 亞 劉茂東 李 英 (河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院腎內科，河北 石家莊 050051)

高尿酸血癥與2型糖尿病(T2DM)關系密切，早期研究只把高尿酸血癥看作糖尿病(DM)慢性并發(fā)癥的預告因子。然而近年來，越來越多的循證醫(yī)學證據顯示，高尿酸已成為DM發(fā)生蛋白尿乃至糖尿病腎病(DN)慢性進展的獨立危險因素〔1〕。本實驗選擇T2DM小鼠模型作為研究對象，應用別嘌醇進行干預后觀察抑制尿酸生成對腎小管間質細胞凋亡的保護作用，并探討其可能的細胞分子學機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 兔抗腎皮質抗增殖因子(Prohibitin)、凋亡誘導因子(AIF)多克隆抗體購自美國proterntech公司;免疫組化試劑盒購自北京中衫金橋生物有限公司;腎組織勻漿丙二醛(MDA)測定試劑盒購自南京建成生物工程有限公司;TUNEL試劑盒購自美國promage公司;別嘌醇購自廣東彼迪藥業(yè)有限公司。

1.2 實驗動物和分組 4～6周齡雄性SPF級肥胖性T2DM病動物模型C57BL/Ksj db/db小鼠12只和對照C57BL/Ksj db/m小鼠6只購自南京大學模式動物研究所。適應性喂養(yǎng)2 w后將db/db小鼠隨機分為2組:db/db小鼠對照組(db/db組)、db/db小鼠+別嘌醇50 mg·kg-1·d-1治療組 (db/db+A組)。db/m小鼠作為正常對照組(db/m組)。

1.3 標本收集 代謝籠收集24 h尿液;股動脈取血，分離血清;用于生化指標檢測。切取腎臟去被膜后，取部分腎皮質置予4%多聚甲醛固定，用于免疫組織化學檢測;取部分腎皮質置予4%戊二醛固定，用于制備電鏡標本;剩余部分腎皮質冷凍于-80℃冰箱，用于提取組織蛋白和組織勻漿用。

1.4 血尿生化指標檢測 用AU2700型自動生化分析儀檢測血糖、血尿酸、血尿素氮、血甘油三酯、24 h尿蛋白定量。

1.5 腎組織勻漿MDA濃度的檢測 稱取100 mg腎實質，放入含有生理鹽水的勻漿器內充分勻漿，制成10%的組織勻漿液，3 000 r/min離心15 min，取上清液，嚴格按照試劑盒說明書進行檢測。取10%腎組織勻漿50 μl，根據試劑盒說明書，用BCA法測定蛋白濃度，硫代巴比妥酸法測定MDA酶含量，以μmol/g Pro表示。

1.6 免疫組化檢測腎皮質prohibitin、AIF的表達 4 μm石蠟切片經梯度脫蠟;3%H2O2室溫孵育10 min;0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液微波抗原修復98℃ 20 min;10%正常山羊血清37℃封閉30 min;然后分別以兔抗prohibitin(1∶100稀釋)及兔抗AIF(1∶200稀釋)多克隆抗體4℃孵育過夜;滴加生物素標記的二抗，37℃孵育30 min;滴加辣根酶標記鏈酶卵白素，37℃孵育30 min;二氨基聯苯胺(DAB)顯色，光鏡觀察;應用HPIAS-2000高清彩色病理圖文分析系統進行圖像采集及半定量分析。

1.7 Western印跡檢測腎皮質prohibitin、AIF的表達 分離各組小鼠的腎皮質約100 mg，加入RIPA蛋白裂解液，勻漿器勻漿后冰浴30 min，4℃12 000 r/min離心，取上清為組織總蛋白;二喹啉甲酸二鈉鹽(BCA)法進行蛋白定量。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)蛋白電泳后轉移至聚偏氟丙(PVDF)膜，5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h;洗膜后加入兔抗prohibitin多克隆抗體(1∶1 000);兔抗 AIF多克隆抗體(1∶1 000)，4℃過夜;再次洗膜后加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(1∶4 000稀釋)，37℃孵育2 h;洗膜后加電化學發(fā)光法(ECL)試劑發(fā)光，Gel-pro分析軟件對條帶進行統計分析，以目的條帶與β-actin條帶光密度比值作為蛋白相對表達量。

1.8 透射電鏡觀察腎小管上皮細胞超微結構 腎組織4%戊二醛溶液固定后，經脫水、滲透、包埋，制作超薄切片，透射電鏡下觀察腎小管上皮細胞超微結構改變。

1.9 原位末端標記法(TUNEL)檢測腎小管上皮細胞凋亡4 μm腎組織石蠟切片脫蠟、水合后加入蛋白酶 K室溫消化10 min;再次浸入4%多聚甲醛中，5 min后磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗;滴加rTdT，置于濕盒內避光37℃孵育60 min后置于2×檸檬酸鈉緩沖液(SSC)中，室溫放置15 min，終止反應;PBS漂洗后置于新鮮配置的碘化丙啶(PI)溶液(1 μg/ml)中，室溫放置15 min，去離子水漂洗后，防淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。(520±20)nm熒光下觀察綠色熒光;＞620 nm熒光下觀察紅色的PI。細胞核中有綠色熒光者為陽性細胞(凋亡細胞)。隨機選取5個高倍視野(×400)計算陽性細胞數目，以陽性細胞數/100為凋亡指數(AI)。

1.10 統計學方法 應用SPSS13.0軟件進行分析，計量資料用s表示，多樣本組間比較采用單樣本方差分析，兩兩比較采用q檢驗。

2 結果

2.1 血尿生化指標變化 在12 w末db/db組血糖、血尿酸、血尿素氮、血甘油三酯及24 h尿蛋白定量水平均明顯高于db/m組(P＜0.05)，db/db+A組血尿酸、血尿素氮及24 h尿蛋白定量水平較同時期db/db組降低(P＜0.05)。見表1。

2.2 各組小鼠腎組織MDA含量的變化 db/db組小鼠腎組織勻漿MDA濃度明顯高于db/m組(P＜0.05);db/db+A組較db/db組有所下降(P＜0.05)，但仍高于正常對照組。見表1。

表1 各組小鼠12 w末血尿生化指標和腎皮質MDA含量比較(s，n=6)

表1 各組小鼠12 w末血尿生化指標和腎皮質MDA含量比較(s，n=6)

與 db/m 組比較:1)P＜0.05;與 db/db組比較:2)P＜0.05;圖2 同

組別 血糖(mmol/L)血尿酸(μmol/L)尿素氮(mmol/L)甘油三酯(mmol/L)尿蛋白(mg/24h)MDA(μmol/g.pro).21 5.14±0.85 1.36±0.12 db/db 29.13±4.561) 166.35±36.581) 9.45±1.371) 3.39±0.871) 45.44±5.551) 2.64±0.331)db/db+A 27.46±6.111) 80.74±13.052) 7.75±0.862) 2.97±0.631) 22.78±2.622) 1.79±0.152)db/m 6.27±1.13 68.54±12.17 6.29±0.95 0.42±0

2.3 各組小鼠腎組織prohibitin、AIF蛋白的表達 免疫組化結果顯示:在db/m組可見prohibitin蛋白的陽性表達，主要定位于腎小管上皮細胞和腎間質細胞的胞質，胞核內亦有較弱表達，在腎小球固有細胞無明顯陽性表達。db/db組prohibitin蛋白表達強度較db/m組減弱，db/db+A組prohibitin蛋白表達仍低于db/m組，但較db/db組有所增強。正常對照組AIF陽性表達弱，主要分布在腎小球固有細胞和腎小管上皮細胞核周圍的胞質中，染色淺而少;db/db組AIF陽性表達明顯增多、增強，且胞核亦可見少量表達，提示核轉位的可能;db/db+A組AIF蛋白表達低于db/db組。見圖1。

Western印跡結果顯示:與db/m組相比，db/db組小鼠腎皮質內Prohibitin蛋白表達減弱(P＜0.01)，db/db+A組較 db/db組有所增強(P＜0.01)，AIF蛋白在db/m組表達很低，而db/db組較正常對照組明顯增強(P＜0.01);db/db+A組較db/db組有所下降(P＜0.01)。見圖2。

2.4 各組小鼠腎小管上皮細胞電鏡表現 電鏡結果顯示，db/db組腎小管上皮細胞中線粒體出現腫脹、空泡變、膜及內部嵴結構消失等病理改變，而db/db+A組線粒體病變較db/db組減輕。見圖3。

圖1 各組小鼠12 w末腎組織prohibitin、AIF蛋白表達(免疫組化，×400)

圖2 各組小鼠12 w末腎組織prohibitin、AIF蛋白表達(Western印跡)

圖3 各組小鼠12周末腎小管上皮細胞電鏡表現(×12 000)

2.5 TUNEL檢測結果 12 w末，正常對照組小鼠偶見腎小管上皮細胞凋亡，db/db組小鼠腎小管上皮細胞及間質細胞凋亡數量較db/m組明顯增多 (P＜0.01)，db/db+A組腎小管上皮細胞凋亡少于db/db組，但仍高于正常對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)。見圖4。

圖4 各組小鼠腎組織細胞凋亡情況(TUNEL，×400)

3 討論

高尿酸血癥作為代謝綜合征的重要組分，其對T2DM及其并發(fā)癥的影響越來越不容忽視。有研究指出血尿酸是T2DM患者尿白蛋白排泄率的獨立相關因素〔2〕。另有橫斷面流行病學調查顯示，高尿酸血癥是慢性腎臟病進展的重要危險因素〔3〕。目前臨床最常用的降尿酸藥物為別嘌醇，它是次黃嘌呤的同分異構體，可抑制黃嘌呤氧化酶活性，進而抑制尿酸生成。已有臨床隨機雙盲對照試驗證實，別嘌醇可降低DM患者的蛋白尿水平〔4〕。也有動物實驗顯示，別嘌醇可改善DM大鼠腎臟損害的進程〔5〕。進一步提示早期識別和干預高尿酸血癥對延緩DN的進展具有重要意義。本研究中別嘌醇干預組血尿酸、血尿素氮及蛋白尿水平較DM組有所改善，提示降低血尿酸水平確對DN的進展具有保護作用。

腎小管間質纖維化是腎臟病發(fā)展至終末期的共同通路，其嚴重程度與腎臟疾病的預后關系密切。越來越多的研究已經證實，在DN早期就已有腎小管間質的損傷發(fā)生，其進展程度和腎功能惡化速度的相關性較腎小球硬化更為密切〔6〕。既往研究已證實，DN時腎小管上皮細胞可出現與腎小管間質損傷程度呈正相關的凋亡現象，提示細胞凋亡參與了腎小管間質病變進程〔7〕。尿酸在腎臟排泄時可100%通過腎小球濾過，然后再通過腎小管上皮細胞的重吸收和再分泌過程，最終約為8% ～12%的尿酸排出體外。由此可見，腎小管上皮細胞是尿酸在腎臟作用最直接的靶細胞之一，高尿酸可能是誘導腎小管間質病變的又一重要危險因素。既往研究指出，尿酸可能通過啟動氧化應激、炎癥反應、誘導細胞轉分化和凋亡等機制導致腎小管間質損傷〔8～10〕，但其中涉及的具體途徑還有待進一步證實。

MDA是病理狀態(tài)下活性氧產生過多攻擊人體生物膜中的多不飽和脂肪酸，導致脂質過氧化形成的脂質過氧化物，檢測MDA含量?？煞从丑w內脂質過氧化程度，間接反映細胞氧化損傷的程度。本實驗中db/db組小鼠與db/m組相比，腎皮質中MDA含量明顯升高，提示db/db組DM小鼠在病變早期腎組織內氧化與抗氧化的平衡即被打破，腎臟氧化損傷增強。TUNEL檢測結果顯示，db/db組小鼠腎小管上皮細胞及間質細胞凋亡數量較db/m組明顯增多，db/db+A組腎小管上皮細胞凋亡少于db/db組，提示降低血尿酸水平可減少T2DM腎組織氧化損傷以及腎小管間質的細胞凋亡。

目前認為細胞凋亡可通過兩條經典途徑啟動，即線粒體途徑和死亡受體途徑。其中線粒體途徑仍占主導地位。線粒體是細胞產生活性氧簇的重要部位，活性氧簇參與氧化應激反應，當活性氧表達增多時可刺激線粒體膜電位異常，線粒體內促凋亡物質細胞色素C，AIF等外溢，激活線粒體凋亡信號途徑導致細胞凋亡。AIF是一種位于線粒體膜間隙、介導非caspase依賴途徑的凋亡相關蛋白，當線粒體凋亡途徑被激活，可致其發(fā)生核轉位而誘導細胞的凋亡。有研究顯示，尿酸誘導血管內皮細胞受損與其致線粒體結構功能異常有關〔11〕。上述研究結果提示，在T2DM小鼠模型中，高尿酸血癥所致細胞氧化損傷與凋亡可能均與線粒體結構和功能正常與否關系密切。本實驗電鏡結果顯示，db/db組腎小管上皮細胞中線粒體出現腫脹、膜及內部嵴結構消失等病理改變，而db/db+A組線粒體病變較db/db組減輕。提示抑制尿酸水平對于維持T2DM腎小管上皮細胞線粒體正常結構有益。

2011年，Quan等〔12〕應用尿酸刺激腎小管上皮細胞檢測出數十種與細胞增殖和凋亡有關的蛋白變化，并指出其中prohibitin可能與腎小管上皮細胞凋亡有關。Prohibitin是一種廣泛分布于多種生物細胞中高度保守的蛋白，根據細胞種類不同，其可定位于線粒體內膜、細胞核、細胞膜中，參與細胞增殖、分化、衰老、凋亡等多種生物學進程。但其最早是作為線粒體內膜上的分子伴侶蛋白被發(fā)現和認識的，研究顯示，Prohibitin參與了線粒體呼吸鏈復合物亞單位的裝配過程并可維護mtDNA的正常結構和復制數量，提示Prohibitin在維持線粒體的結構和功能方面意義重大〔13〕。黃文彥等〔14〕在分析腎間質纖維化大鼠的基因表達譜時也發(fā)現了prohibitin明顯下調，且其主要表達于腎小管間質細胞，而腎小球固有細胞表達卻極少，推測其可能是介導腎間質纖維化的重要基因之一。還有研究報道，prohibitin缺失可誘導胰島B細胞線粒體損傷進而影響細胞功能和存活，這可能是導致DM進展的機制之一〔15〕。Prohibitin還可抑制H2O2誘導的心肌細胞凋亡〔16〕。提示prohibitin在維持細胞線粒體正常結構和功能，抑制細胞凋亡方面發(fā)揮了重要作用。本實驗結果提示別嘌醇可能通過降低T2DM小鼠血尿酸水平，進而抑制腎小管間質細胞prohibitin蛋白表達下調，減輕線粒體結構和功能損傷，使線粒體內活性氧生成減少，細胞氧化應激反應減輕，同時抑制線粒體信號途徑啟動后AIF核轉位誘導的細胞凋亡，達到防止腎間質纖維化的作用。

綜上所述，本研究結果表明，在T2DM小鼠病變早期即存在腎組織氧化應激損傷和腎小管上皮細胞的凋亡增加，別嘌醇干預可減低血尿酸水平，減少腎組織的氧化損傷和細胞凋亡，其機制可能是通過維持prohibitin的表達，穩(wěn)定線粒體結構與功能，抑制活性氧產生和AIF外溢誘導的細胞凋亡。

1 Cai XL，Han XY，Ji LN.High-normal serum uric acid is associated with albuminuria and impaired glomerular filtration rate in Chinese type 2 diabetic patients〔J〕.Chin Med J(Engl)，2011;124(22):3629-34.

2 Behradmanesh S，Horestani MK，Baradaran A，et al.Association of serum uric acid with proteinuria in type 2 diabetic patients〔J〕.J Res Med Sci，2013;18(1):44-6.

3 Hsu CY，Iribarren C，Mcculloch CE，et al.Risk factors for end-stage renal disease:25-year follow-up〔J〕.Arch Intern Med，2009;169(4):342-50.

4 Momeni A，Shahidi S，Seirafian S，et al.Effect of allopurinol in decreasing proteinuria in type 2 diabetic patients〔J〕.Iran J Kidney Dis，2010;4(2):128-32.

5 Wang C，Pan Y，Zhang QY，et al.Quercetin and allopurinol ameliorate kidney injury in STZ-treated rats with regulation of renal NLRP3 inflammasome activation and lipid accumulation〔J〕.PLoS One，2012;7(6):e38285.

6 Simonson MS.Phenotypic transitions and fibrosis in diabetic nephropathy〔J〕.Kidney Int，2007;71(9):846-54.

7 Rane MJ，Song Y，Jin S，et al.Interplay between Akt and p38 MAPK pathways in the regulation of renal tubular cell apoptosis associated withdiabetic nephropathy〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol，2010;298(1):F49-61.

8 Sanchez-Lozada LG，Soto V，Tapia E，et al.Role of oxidative stress in the renal abnormalities induced by experimental hyperuricemia〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol，2008;295(4):F1134-41.

9 Zhou Y，Fang L，Jiang L，et al.Uric acid induces renal inflammation via activating tubular NF-κB signaling pathway〔J〕.PLoS One，2012;7(6):e39738.

10 Ryu ES，Kim MJ，Shin HS，et al.Uric acid-induced phenotypic transition of renal tubular cells as a novel mechanism of chronic kidney disease〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol，2013;304(5):F471-80.

11 Sánchez-Lozada LG，Lanaspa MA，Cristóbal-García M，et al.Uric acidinduced endothelial dysfunction is associated with mitochondrial alterations and decreased intracellular ATP concentrations〔J〕.Nephron Exp Nephrol，2012;121(3-4):e71-8.

12 Quan H，Peng X，Liu S ，et al.Differentially expressed protein profile of renal tubule cell stimulated by elevated uric acid using SILAC coupled to LC-MS〔J〕.Cell Physiol Biochem，2011;27(1):91-8.

13 Zhou TB，Qin YH.Signaling pathways of prohibitin and its role in diseases〔J〕.J Recept Signal Transduct Res，2013;33(1):28-36.

14 黃文彥，孫 驊，潘曉勤，等.腎間質纖維化大鼠纖維化相關基因的初步篩查〔J〕.中華兒科雜志，2003;41(11):855-6.

15 Supale S，Thorel F，Merkwirth C，et al.Loss of prohibitin induces mitochondrial damages altering β-cell function and is survival and responsible for gradual diabetes development〔J〕.Diabetes，2013;62(10):3488-99.

16 Jia Y，Zhou F，Deng P，et al.Interleukin 6 protects H2O2-induced cardiomyocytes injury through upregulation of prohibitin via STAT3 phosphorylation〔J〕.Cell Biochem Funct，2012;30(5):426-31.