龔興瑞 陳永梅 秦成名 許先成 王賢裕 向 勇

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院麻醉科，湖北 十堰 442000)

肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生與平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥浸潤(rùn)和異常增殖，肺動(dòng)脈血栓形成密切相關(guān)〔1〕。臨床治療是針對(duì)基礎(chǔ)疾病和誘發(fā)因素進(jìn)行對(duì)癥治療，但療效并不滿意。脂氧素受體激動(dòng)劑(BML-111)可通過激動(dòng)脂氧素受體從而發(fā)揮一種促炎癥介質(zhì)消退作用，其機(jī)制包括抑制多條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活，抑制炎癥介質(zhì)浸潤(rùn)等，因此有用來治療肺動(dòng)脈高壓的可能〔2〕。本試驗(yàn)觀察BML-111對(duì)左向右分流型肺動(dòng)脈高壓大鼠肺動(dòng)脈壓力及肺血管病理改變的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年SD大鼠30只，體重400～450 g，由湖北醫(yī)藥學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，隨機(jī)將大鼠平均分為三組:C組、B1組、B2組。實(shí)驗(yàn)器材包括:壓力換能器、手術(shù)顯微鏡、手術(shù)器械、肝素、水合氯醛、青霉素等。

1.2 模型制備 將鹽酸戊乙奎醚注射液1 mg和氟哌利多5 mg加入100 ml水合氯醛，采用腹腔注射3 ml/100 g進(jìn)行麻醉，麻醉后將大鼠固定于手術(shù)臺(tái)上，腹腔注射肝素2 mg/kg，術(shù)中持續(xù)使用面罩給氧，流量為1 L/min。動(dòng)物模型的構(gòu)建:將大鼠左側(cè)頸斜形切開，游離左側(cè)頸總動(dòng)脈和頸外靜脈，對(duì)頸外靜脈遠(yuǎn)心端結(jié)扎，頸總動(dòng)脈下段用血管夾夾住，于發(fā)出頸外分支前結(jié)扎剪斷，剪取1 cm的BD20G動(dòng)脈穿刺針作為導(dǎo)管連接頸總動(dòng)脈近心端和頸外靜脈近心端，結(jié)扎固定好導(dǎo)管，剪斷頸外靜脈遠(yuǎn)端，松開血管夾，頸外靜脈變紅且有搏動(dòng)則說明分流成功灑青霉素5萬單位后縫合傷口，將大鼠放回籠中飼養(yǎng)。6 w后開始，C組每天腹腔注射生理鹽水，B1組每天腹腔注射1 mg·kg-1·d-1BML-111，B2 組每天腹腔注射 3 mg·kg-1·d-1BML-111連續(xù)4 w后將大鼠取出進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。大鼠一般情況所有大鼠分流術(shù)后與術(shù)前相比，進(jìn)食、活動(dòng)減少，毛發(fā)粗糙，精神較差。C組有一只大鼠在第9周死亡，進(jìn)入最后實(shí)驗(yàn)的C組、B1、B2組分別有大鼠9只、10只、10只。

1.3 肺動(dòng)脈壓力檢測(cè) 將大鼠按照如前的方式行腹腔注射麻醉，固定于手術(shù)臺(tái)上，分離右側(cè)頸外靜脈，將右心導(dǎo)管充滿肝素鹽水后插入，連接換能器并與監(jiān)護(hù)儀相連，當(dāng)置入導(dǎo)管進(jìn)入右心室時(shí)記錄其右室收縮壓(RDP)，監(jiān)護(hù)儀出現(xiàn)肺動(dòng)脈波形時(shí)記錄其平均肺動(dòng)脈壓力(PAMP)。壓力測(cè)量完畢后處死大鼠，游離右室(RV)和左室(LV)+室間隔(S)并稱重，計(jì)算 RV/(LV+S)。

1.4 組織病理學(xué)測(cè)定 用生理鹽水沖洗肺動(dòng)脈剩余的血液，同時(shí)用10%的中性甲醛在20 cm H2O壓力下經(jīng)氣管注入肺內(nèi)，約5 min后切取左肺于10%甲醛中固定48 h，常規(guī)石蠟包埋、切片，進(jìn)行染色。

1.5 肺小動(dòng)脈中膜厚度比 將處理好的切片經(jīng)Elastin-Van Gieson染色，然后在光鏡下觀察，用Simple PCI圖像采集系統(tǒng)處理，分別測(cè)量計(jì)算內(nèi)、外彈力板之間的距離(R)和血管外徑(D)，每只大鼠測(cè)量30根肺部小動(dòng)脈，直徑位于30～100 μm，由公式計(jì)算中膜厚度百分比:2R/D100%。

1.6 肺小動(dòng)脈纖維化百分比 將處理好的標(biāo)本經(jīng)Masson染色，在400倍顯微鏡下進(jìn)行觀察，用圖像處理軟件將藍(lán)染的纖維組織和紅色的其他組織以及白色的背景分割開，計(jì)算藍(lán)染組織占總視野百分比。

1.7 細(xì)胞間黏附分子(ICAM-1)和白介素(IL)-8測(cè)定 將肺組織剪下后用緩沖液沖洗干凈，加入裂解緩沖液于液氮下磨碎，離心后取上清液于-80℃深低溫冰箱保存。采集大鼠靜脈血2 ml，5 000 r/min離心5 min后取上清液于-80℃深低溫冰箱保存。用ELISA測(cè)量肺組織勻漿和血漿ICAM-1和IL-8的含量，試劑購(gòu)自R＆D公司，操作步驟按照說明書進(jìn)行。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，選用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析，采用LSD法分析各組與間差異。

2 結(jié)果

2.1 血流動(dòng)力學(xué)改變 經(jīng)術(shù)后10 w的飼養(yǎng)，B1、B2組大鼠相比 C 組，PAMP、RV/(LV+S)、RVSP 明顯降低(P＜0.05);且 B2組相比B1組 PAMP、RVSP降低更明顯(P＜0.05)，見表1。

表1 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較(s)

表1 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較(s)

與 C 組比較:1)P＜0.05;與 B1 組比較:2)P＜0.05，下表同

組別 n PAMP(mmHg)RV/(LV+S)RVSP(mmHg)9 29.6±4.2 0.323±0.036 39.2±5.8 B1 組 10 25.4±3.31) 0.292±0.0301) 33.2±4.61)B2 組 10 22.3±2.81)2) 0.281±0.0281) 28.8±4.11)2)P值C組0.009 0.012 0.005

2.2 肺血管病理改變 B1、B2組大鼠相比C組，肺小動(dòng)脈病理下觀察發(fā)現(xiàn)其中膜厚度比和纖維化比均明顯減輕，且B2組肺小動(dòng)脈中膜厚度比略小于B1組(P＜0.05)。見表2。

表2 各組大鼠肺血管中膜厚度比和纖維化比(s，%)

表2 各組大鼠肺血管中膜厚度比和纖維化比(s，%)

組別 n 25.1±4.9 32.6±7.8 B1 組 10 20.6±3.41) 24.3±4.91)B2 組 10 17.1±3.01)2) 21.2±4.61)P值中膜厚度百分比 纖維化百分比C組9 0.008 0.004

2.3 ICAM-1和IL-8測(cè)定 B1、B2組大鼠相比C組，肺組織和血漿中ICAM-1和IL-8濃度均明顯降低(P＜0.05)，且血漿中ICAM-1和IL-8含量B2組比B1組降低更明顯(P＜0.05)。見表3。

表3 各組大鼠肺組織、血漿ICAM-1和IL-8含量(s)

表3 各組大鼠肺組織、血漿ICAM-1和IL-8含量(s)

L)9 27.4±4.1 182±28 24.3±4.1 136±24 B1 組 10 19.7±3.91) 143±211) 18.6±3.71) 108±171)B2 組 10 17.2±3.71) 126±151)2) 16.9±3.11) 92±121)2)P值C組0.014 0.006 0.010 0.002

3 討論

肺動(dòng)脈高壓是小兒先天性心臟病常見并發(fā)癥，早期采用手術(shù)治療糾正畸形，可有效預(yù)防肺動(dòng)脈高壓形成，但是有部分小兒在畸形矯正后肺動(dòng)脈高壓仍然向前發(fā)展。大量高速血流的沖擊，血液的剪切力是肺動(dòng)脈高壓發(fā)生的起始因素，它可造成肺部小動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷，長(zhǎng)時(shí)間可造成肺小動(dòng)脈中層增厚，新生內(nèi)膜形成，肺血管纖維化，并最終導(dǎo)致管腔狹窄，小動(dòng)脈閉鎖，任由其發(fā)展最后導(dǎo)致右心衰竭，病人死亡〔3〕。血液流變學(xué)的改變是肺動(dòng)脈高壓的始動(dòng)因素，炎癥反應(yīng)則是肺動(dòng)脈高壓發(fā)展過程的一個(gè)重要促進(jìn)因素，通常包括一些IL釋放、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、樹突細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的激活，這些炎癥因子和介質(zhì)和肺動(dòng)脈高壓發(fā)展過程相伴，甚至與疾病預(yù)后有關(guān)系〔4〕，因此通過抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)是治療肺動(dòng)脈高壓的重要途徑。

脂氧素是人體內(nèi)重要的促進(jìn)炎癥消退的物質(zhì)，在機(jī)體受到外來打擊時(shí)，它可以抑制炎癥反應(yīng)的程度，從而避免炎癥反應(yīng)失控，減輕炎癥反應(yīng)所致的機(jī)體損傷，這些作用在肺、肝、心等多種器官損傷模型中已經(jīng)得到證實(shí)〔5～7〕，其抗炎機(jī)制主要包括脂氧素受體激活后可有效抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖趨化，抑制白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子分泌的分泌和ICAM-1的表達(dá)等。由于脂氧素在人體內(nèi)半衰期極短，因此試驗(yàn)中采用脂氧素受體激動(dòng)劑BML-111腹腔注射，其與脂氧素作用機(jī)制相同，都是通過作用脂氧素受體而發(fā)揮作用，產(chǎn)生效果類似〔8〕。

大鼠分流型肺動(dòng)脈高壓模型主要有腹主動(dòng)脈-下腔靜脈分流型、左頸總動(dòng)脈-頸外靜脈分流型，本實(shí)驗(yàn)中采用吻合左頸總動(dòng)脈-頸外靜脈建立肺動(dòng)脈高壓動(dòng)脈模型，主要是考慮到腹主動(dòng)脈和下腔靜脈位置較深，操作難度較頸部大，采用血管吻合，流量不夠穩(wěn)定;而頸部操作位置表淺，采用套管吻合，流量固定，由于顱內(nèi)大腦動(dòng)脈環(huán)的血流再分布，大鼠沒有腦缺血性損傷的表現(xiàn)。C組肺動(dòng)脈壓力、右心壓力更高，肺血管病變程度更重，右室肥厚更加明顯。這種肺動(dòng)脈壓力與肺血管病理改變的差異可能與BML-111作用于受體后減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)有關(guān)，而且實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)B2組3 mg·kg-1·d-1的劑量效果好于B1組1 mg·kg-1·d-1。

綜上，BML-111作用于脂氧素受體后，可減輕大鼠肺動(dòng)脈高壓的發(fā)展，減慢肺血管病變形成，其作用機(jī)制可能與減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)有關(guān)。通過激動(dòng)脂氧素受體抑制炎癥反應(yīng)治療肺動(dòng)脈高壓可能有一定的作用。

1 Humbert M，Montani D，Perros F，et al.Endothelial cell dysfunction and cross talk between endothelium and smooth muscle cells in pulmonary arterial hypertension〔J〕.Vasc Pharmacol，2008;49(4-6):113-8.

2 Wu SH，Liao PY，Dong L，et al.Signal pathway involved in inhibition by lipoxin A(4)of production of interleukins induced in endothelial cells by lipopolysaccharide〔J〕.Inflamm Res，2008;57(9):430-7.

3 Sakao S，Tatsumi K，Voelkel NF.Endothelial cells and pulmonary arterial hypertension:apoptosis，proliferation，interaction and transdifferentiation〔J〕.Respir Res，2009;10(1):95.

4 Price LC，Wort SJ，Perros F，et al.Inflammation in pulmonary arterial hypertension〔J〕.Chest，2012;141(1):210-21.

5 Birnbaum Y，Ye Y，Lin Y，et al.Augmentation of myocardial production of 15-epi-lipoxin-a4 by pioglitazone and atorvastatin in the rat〔J〕.Circulation，2006;114(9):929-35.

6 Jin SW，Zhang L，Lian QQ，et al.Posttreatment with aspirin-triggered lipoxin A4 analog attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice:the role of heme oxygenase-1〔J〕.Anesth Analg，2007;104(2):369-77.

7 Zhang L，Wan J，Li H，et al.Protective effects of BML-111，a lipoxin A(4)receptor agonist，on carbon tetrachloride-induced liver injury in mice〔J〕.Hepatol Res，2007;37(11):948-56.

8 Chen Y，Hao H，He S，et al.Lipoxin A4 and its analogue suppress the tumor growth of transplanted H22 in mice:the role of antiangiogenesis〔J〕.Mol Cancer Ther，2010;9(8):2164-74.