王宏英 劉 磊 譚 巖 方艷秋 (長春中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院生物化學教研室，吉林 長春 307)

微循環(huán)功能障礙是導致血管性癡呆(VD)發(fā)生的原因之一〔1，2〕。養(yǎng)血清腦顆粒是在補血名方“四物湯”的基礎上加減而成。前期基礎研究顯示，養(yǎng)血清腦顆粒具有擴張腦血管，增加腦血流量，改善大腦微循環(huán)，增加大腦供血供氧，降低血黏度，抑制血小板聚集，鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛等功能。臨床研究顯示養(yǎng)血清腦顆粒不但可以有效改善慢性腦供血不足引起的頭暈、頭痛、頭重等癥狀，同時對高血壓引起的頭痛頭暈、緊張性頭痛、抑郁癥引起的失眠健忘等療效確切〔3〕。海馬體是與學習記憶等高級功能有密切關系的重要功能區(qū)，對缺血低灌注損傷有易感性，海馬區(qū)神經元凋亡相關蛋白可能在VD的發(fā)病過程中具有重要作用〔4〕。凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax等改變最終可引起海馬區(qū)細胞凋亡〔5〕。本文擬觀察養(yǎng)血清腦顆粒對VD大鼠學習記憶能力和海馬組織凋亡蛋白變化的影響，以期從凋亡角度闡明養(yǎng)血清腦顆粒對VD的防治作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 VD大鼠模型制備 健康雌性Wistar大鼠36只，鼠齡4～7個月，體重280～350 g，吉林大學實驗動物中心提供和喂養(yǎng)。隨機分為假手術組(正常對照組)、模型對照組(癡呆組)、養(yǎng)血清腦顆粒組。大鼠用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔注射麻醉，頸部正中切口，分離雙側頸總動脈，分別結扎雙側頸總動脈的遠近端，并從中間剪斷，以確保阻斷頸總動脈血流。假手術組除不結扎、不剪斷雙側頸總動脈外，其余過程與手術組相同。養(yǎng)血清腦顆粒組術前10 d及術后每天用養(yǎng)血清腦顆粒灌胃4.8 g/kg體重，共灌胃45 d。假手術組，模型對照組大鼠給予生理鹽水3 ml/d，1次/d灌胃。

1.2 實驗試劑及儀器 養(yǎng)血清腦顆粒浸膏(簡稱養(yǎng)血清腦顆粒，批準文號:國藥準字Z10960082)，由天士力制藥集團提供，每克浸膏含生藥7 g，以蒸餾水將浸膏稀釋4.8 g/ml，每只大鼠給藥容積為10 ml/kg。SP染色試劑盒購于邁新公司;抗Bcl-2、抗Bax、抗β-actin、HRP標記IgG，均為cell signaling產品;Morris水迷宮，中國醫(yī)學科學院治療所生產BIO-RAD凝膠圖像分析系統，PERIFLUX SYSTEM 5000激光多普勒血流儀，立體定位儀，牙科鉆。

1.3 記憶功能的測定 于造模后第15天采用Morris水迷宮進行大鼠記憶功能的測定〔6〕。實驗訓練階段連續(xù)進行4 d，每天訓練2次，進行Morris水迷宮的定位航行實驗訓練。之后連續(xù)4 d進行定位巡航實驗，每日2次，計算平均成績。

1.4 HE染色 行為學實驗結束后，各組大鼠斷頭處死，立即剝離顱骨，將全部腦組織取出，置于4%多聚甲醛固定24 h，將充分固定好的腦組織切去嗅球及小腦，以乳頭體中部為切點，將腦冠狀切成2片，常規(guī)脫水，石蠟包埋。每份標本選取海馬為觀察點，保證同一時間點各組標本選取的位置一致，連續(xù)切片5張，片厚4 μm。石蠟塊切片進行常規(guī)HE染色。

1.5 免疫組化方法檢測活化的caspase-3表達 使用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶免疫組化染色超敏試劑盒，用生物素標記的第二抗體與鏈霉菌抗生物素蛋白連接的過氧化酶及基質色素混合液測定細胞和組織中的caspase-3(p20)。

1.6 Western印跡檢測Bcl-2，Bax蛋白表達量變化 取大鼠的腦組織，立即放入預冷的RIPA裂解緩沖液中，冰上超聲勻漿后，4℃，12 000 r/min離心30 min，取上清，G250法測定總蛋白含量，將蛋白樣品濃度調整為40 μg/μl。10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜2 h，10%脫脂奶封閉液1 h。棄去封閉液，加入用封閉液稀釋的一抗工作液(抗Bcl-2和Bax及抗β-actin抗體)，4℃振搖孵育過夜。TBST洗膜3次，加入1∶3 000稀釋的相應二抗，室溫反應1 h;TBST洗膜3次，增強化學發(fā)光試劑顯色，BandScan5.0分析軟件進行灰度分析，以目的蛋白條帶的灰度值與β-actin蛋白條帶的灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.7 海馬局部腦血流量(rCBF)測定〔7〕參照《大鼠腦立體定位圖譜》，應用PERIFLUX SYSTEM 5000激光多普勒血流儀測定每只大鼠海馬腦血流量變化3～5 min，記錄LDP輸出信號，經PERISOFT程序處理，計算平均值。

1.8 統計學分析 采用SPSS10.0軟件，計量資料以s表示，多樣本均數采用單因素方差分析(one way ANOVA)，組間均數比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 大鼠認知功能比較 定位巡航試驗中，模型組大鼠尋找平臺的潛伏期較假手術組明顯延長(P＜0.05)，而養(yǎng)血清腦顆粒組大鼠尋找潛伏期與模型組比較明顯縮短(P＜0.05)。見表1。

表1 各組VD大鼠水迷宮潛伏期比較(n=6，s，s)

表1 各組VD大鼠水迷宮潛伏期比較(n=6，s，s)

與假手術組比較:1)P＜0.05;與模型對照組比較:2)P＜0.05

組別 D3 D4 D5 D6假手術組 33.2±14.5 28.1±11.50 20.6±8.81 12.6±6.92模型對照組 104.4±27.31)94.4±25.21)72.9±17.21)54.4±14.31)養(yǎng)血清腦顆粒組 43.6±13.52)36.4±12.72)27.9±10.12)18.4±9.32)

2.2 HE染色結果 假手術組的大腦皮層及海馬神經細胞染色均一，結構完整，細胞膜、核膜清晰;神經元數量多，體積大，核圓，核仁明顯。模型組大鼠大腦皮層及海馬可見神經元數量明顯減少，細胞排列紊亂，細胞外空隙增大，多數神經元細胞核呈固縮狀、胞質深染、胞膜核膜界限不清晰，可見壞死的神經元。養(yǎng)血清腦顆粒大鼠的大腦皮層及海馬神經元數量較多，排列整齊，神經元體積大，核圓，核仁明顯，偶見神經元細胞核固縮，少有神經元壞死現象。見圖1。

圖1 大鼠海馬HE染色結果(×200)

2.3 養(yǎng)血清腦顆粒對VD大鼠腦內海馬區(qū)神經元活化的caspase-3表達的影響 假手術組海馬caspase-3陽性細胞數很少，陽性反應弱。模型對照組大鼠腦組織海馬有較多的caspase-3陽性(凋亡細胞)。養(yǎng)血清腦顆粒組與模型對照組相比，細胞陽性反應顯著減弱(P＜0.05)，見圖2。

2.4 大鼠腦組織Bcl-2，Bax蛋白表達量變化 與假手術組比較，模型對照組大鼠海馬區(qū)的Bcl-2蛋白表達水平顯著降低(P＜0.05);養(yǎng)血清腦顆粒組大鼠海馬內Bcl-2蛋白表達水平與模型對照組相比明顯升高(P＜0.05)。模型對照組大鼠海馬區(qū)的Bax蛋白表達水平與假于術組大鼠相比顯著升高(P＜0.05);養(yǎng)血清腦顆粒組大鼠海馬內Bax蛋白表達水平與模型組相比明顯減低(P＜0.05)。見圖3。

圖2 大鼠海馬caspase-3陽性細胞(SP，×200)

圖3 大鼠腦組織Bcl-2，Bax蛋白的變化

2.4 大鼠海馬腦血流變化 與假手術組〔(35.21±5.53)PU〕比較，模型對照組大鼠海馬區(qū) rCBF〔(24.43±4.23)PU〕明顯降低，養(yǎng)血清腦顆粒可顯著提高大鼠海馬區(qū) rCBF〔(30.61±4.85)PU〕(P＜0.05)。

3 討論

VD是由于腦血管疾病引起的以學習認知功能(即語言、視空間、定向力或抽象思維)減退的神經性疾病。由于血管發(fā)病的危險因素是可以避免的，所以對VD盡早實施積極有效的藥物干預，對于緩解或減輕VD病人癥狀，甚至逆轉認知功能障礙及損傷具有重要的意義〔8〕。臨床研究發(fā)現，皮質下區(qū)域(包括腦室周圍白質、基底節(jié)和海馬)腦血流量慢性持續(xù)性下降可能是導致VD的主要原因之一，這種認知障礙經過治療可以部分緩解?？刂芕D危險因素，特別是低灌注，可以防止VD的進展〔9〕。

慢性腦灌注不足是VD發(fā)病的主要病因，故本研究采用2VO法致大鼠VD模型。利用Morris水迷宮定向航行實驗證實，VD大鼠出現持續(xù)性認知功能障礙。研究顯示〔10〕，大鼠持續(xù)性腦血流量下降可導致神經細胞凋亡，凋亡是腦缺血時神經細胞脫失的主要原因之一。本研究采用激光多普勒血流儀監(jiān)測大鼠額葉皮質rCBF情況，結果顯示模型對照組腦血流量持續(xù)下降，同時大鼠空間學習記憶能力下降，逃避潛伏期明顯延長。海馬是認知功能相關的重要腦區(qū)，海馬神經元的存活數量直接影響神經元突觸的可塑性。研究認為〔11〕，大鼠認知改變與海馬CA1區(qū)凋亡有很強的相關性。在凋亡基因調控中，bcl-2家族起到重要調節(jié)作用，減少Bcl-2、增加Bax的表達可激活caspase-3和p53，進一步誘發(fā)大鼠海馬區(qū)神經元的凋亡。我們通過免疫組化染色證實了慢性缺血可以引起海馬區(qū)神經細胞活化的caspase3表達增加，且隨著缺血時間的延長大鼠出現持續(xù)性認知功能障礙，說明細胞凋亡參與慢性缺血致VD導致的認知功能障礙的過程。研究中我們發(fā)現，大鼠腦組織均表達一定量Bcl-2與Bax，且二者比值保持相對平衡。養(yǎng)血清腦顆粒的應用一定程度的增加了Bcl-2蛋白表達，降低了Bax蛋白的表達，發(fā)揮抗凋亡的作用。通過行為學也證實，改善凋亡相關蛋白的表達程度與學習記憶能力改善密切相關。

養(yǎng)血清腦顆粒為治療頭痛的三類中藥新藥，能較好改善眩暈、耳鳴、失眠、健忘等相關伴隨癥狀。藥物成分分析顯示，組方中含有的川芎嗪、阿魏酸、芍藥苷等物質成分也有不同程度地抑制血小板聚集、擴張血管、改善微循環(huán)等作用。基礎研究發(fā)現，養(yǎng)血清腦顆粒在降壓的同時，能舒張血管，調節(jié)血管活性物質，可以從炎癥相關基因、血管擴張相關基因、免疫相關基因等多方面影響腦基因表達譜。本研究揭示養(yǎng)血清腦顆?？梢栽黾哟笫蠛ｑR區(qū)rCBF，抑制由于缺血導致的神經細胞凋亡，改善大鼠認知功能，可能是防治慢性腦缺血所致VD認知功能障礙的有效手段。

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