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        基于陰離子型環(huán)糊精超分子包合物高靈敏熒光光度分光法檢測(cè)血漿中殘留亞甲藍(lán)Δ

        2014-12-03 03:07:06周群剛謝蓮方敏趙銘唐建華王明元徐軍謝洪平蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院江蘇蘇州53蘇州市中心血站江蘇蘇州5006
        中國(guó)藥房 2014年6期
        關(guān)鍵詞:亞甲藍(lán)羧甲基環(huán)糊精

        周群剛,謝蓮,方敏,趙銘,唐建華,王明元,徐軍,謝洪平#(.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院,江蘇蘇州 53;.蘇州市中心血站,江蘇蘇州 5006)

        為降低臨床上輸血感染病毒的風(fēng)險(xiǎn),增加輸血的安全性,一般采用亞甲藍(lán)光化學(xué)法滅活血漿中的病毒[1]。在滅活病毒以后,需使用特制的濾器濾除85%以上的亞甲藍(lán)[2],最大殘留量為0.2 μmol/L。為了保證用血安全,需要對(duì)血漿中亞甲藍(lán)的殘留量進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)定方法有化學(xué)發(fā)光法[3]、高效液相色譜法[4]及共振瑞利散射法[5]等,這些方法中,有的靈敏度較低,有的需采用固相萃取富集后才能測(cè)定。在原衛(wèi)生部編制的《血站技術(shù)操作規(guī)程(2012年版)》[6]中,利用小柱萃取富集預(yù)處理后以分光光度法檢測(cè)。但是,該方法檢測(cè)靈敏度仍然較低,大多數(shù)樣本的吸光度在《中國(guó)藥典》(2010年版)附錄方法所規(guī)定的0.3以下,預(yù)示著檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。同時(shí),該方法不但操作繁瑣,而且需要大量的血漿,浪費(fèi)寶貴的血漿資源。周群剛等[7]利用電中性的β-環(huán)糊精發(fā)展了一種亞甲藍(lán)增敏熒光分光光度法,以提高檢測(cè)靈敏度,實(shí)現(xiàn)了不經(jīng)分離、富集直接測(cè)定血漿中亞甲藍(lán),表現(xiàn)出了快速、簡(jiǎn)單、需要血漿量少的優(yōu)點(diǎn)。但是,該方法的最低定量限(0.089 μmol/L)與血漿中最大殘留量0.2 μmol/L非常接近,前者僅僅為后者的0.46倍,預(yù)示著該方法存在兩個(gè)問(wèn)題:(1)檢測(cè)信號(hào)的絕對(duì)值較低,導(dǎo)致該方法對(duì)于大多數(shù)的實(shí)際檢測(cè)樣本的信噪比低;(2)樣本的實(shí)際殘留量極有可能低于該定量限,從而導(dǎo)致該方法不能用于有些實(shí)際樣本的檢測(cè)。本文利用陰離子型環(huán)糊精對(duì)亞甲藍(lán)熒光的增敏作用,建立了一種新的檢測(cè)血漿中殘留亞甲藍(lán)的方法。與之前方法相比該方法檢測(cè)限低、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便,具有一定的創(chuàng)新性和應(yīng)用價(jià)值。

        1 材料

        1.1 儀器

        LS-55熒光分光光度計(jì)(美國(guó)Perkin Elmer公司)。

        1.2 藥品與試劑

        亞甲藍(lán)(上海TCI公司,純度>98.5%);羧甲基-β-環(huán)糊精(山東濱州智源生物科技有限公司,純度>98%);其他試劑均為分析純。蘇州市中心血站提供8份非滅活混合人血漿約1000 ml,使用一次性病毒滅活配套裝置中的過(guò)濾器濾除白細(xì)胞,得不含亞甲藍(lán)的血漿,即空白血漿;同時(shí)提供20份經(jīng)亞甲藍(lán)病毒滅活的成品血漿樣本,即待測(cè)血漿。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 溶液配制

        稱取亞甲藍(lán)0.0745 g,置于100 ml量瓶中,用磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 7.2)溶解并稀釋至刻度。準(zhǔn)確量取5.00ml,用PBS定容到100 ml,得貯備液(100μmol/L),避光、密封保存。

        2.2 血漿樣品的制備

        向420μl的待測(cè)血漿中加入344μl的羧甲基-β-環(huán)糊精飽和溶液(0.01 mol/L),使羧甲基-β-環(huán)糊精濃度為4.5 mmol/L,充分混勻,避光放置20 min,即得待測(cè)溶液。同時(shí),用空白血漿按前述方法配制不含亞甲藍(lán)的待測(cè)溶液,即得空白溶液。

        2.3 熒光分光光度法測(cè)定血漿中亞甲藍(lán)含量

        將待測(cè)溶液(或空白溶液)置于熒光比色皿中,以665 nm為激發(fā)波長(zhǎng)、680 nm為發(fā)射波長(zhǎng)、激發(fā)狹縫寬度5 nm、發(fā)射狹縫寬度5 nm、激發(fā)光程2 mm、發(fā)射光程10 mm,測(cè)定其熒光強(qiáng)度,由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算亞甲藍(lán)含量。

        2.4 線性關(guān)系考察

        用亞甲藍(lán)貯備液和空白血漿分別配制含亞甲藍(lán)濃度為0.008、0.05、0.08、0.15、0.20μmol/L的5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)血漿。利用羧甲基-β-環(huán)糊精溶液(0.01 mol/L),按“2.1”項(xiàng)下方法配制標(biāo)準(zhǔn)待測(cè)溶液,再按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)待測(cè)溶液的熒光強(qiáng)度。以扣除空白的待測(cè)溶液的熒光強(qiáng)度為依據(jù),即ΔF=F-F0(其中,F(xiàn)和F0分別為待測(cè)溶液和空白溶液的熒光強(qiáng)度),對(duì)相應(yīng)的亞甲藍(lán)濃度(c)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程為ΔF=73.898 c-0.0734(r=0.9990)。結(jié)果表明,亞甲藍(lán)血藥濃度在0.008~0.2μmol/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

        2.5 包合反應(yīng)時(shí)間

        對(duì)于含亞甲藍(lán)相同濃度的6個(gè)樣本,室溫避光,經(jīng)不同包合反應(yīng)時(shí)間后,測(cè)定其熒光強(qiáng)度(見(jiàn)圖1)。從圖1可知,室溫下反應(yīng)20 min后體系熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定,20、40、60、120 min熒光強(qiáng)度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.57%,熒光至少穩(wěn)定2h。因此本試驗(yàn)采用反應(yīng)20 min后測(cè)定。

        圖1 亞甲藍(lán)熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化Fig 1 Change of fluorescence intensity of methylene blue with time

        2.6 精密度試驗(yàn)

        利用空白血漿和亞甲藍(lán)貯備液,按“2.1”項(xiàng)下方法配制含亞甲藍(lán)0.2、0.08、0.008 μmol/L的3個(gè)高、中、低濃度的待測(cè)溶液,按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定其熒光強(qiáng)度。對(duì)同一個(gè)樣本在同一天內(nèi)測(cè)定11次,以測(cè)得的熒光強(qiáng)度計(jì)算日內(nèi)RSD;對(duì)同一個(gè)樣本連續(xù)測(cè)定11 d,以測(cè)得的熒光強(qiáng)度計(jì)算日間RSD。結(jié)果表明,該方法具有良好的精密度,結(jié)果見(jiàn)表1。

        表1 精密度及回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Results of precision and recovery tests

        2.7 回收率試驗(yàn)

        利用空白血漿和亞甲藍(lán)貯備液,按“2.1”方法分別配制含亞甲藍(lán)0.2、0.08、0.008 μmol/L的3個(gè)高、中、低濃度的待測(cè)溶液,按“2.3”項(xiàng)方法測(cè)定其熒光強(qiáng)度。以每個(gè)樣本連續(xù)測(cè)定5次的熒光強(qiáng)度的平均值按“2.4”項(xiàng)下回歸方程計(jì)算亞甲藍(lán)濃度,并據(jù)此計(jì)算回收率,結(jié)果見(jiàn)表1。該結(jié)果表明本文所建立的方法具有良好的回收率。

        2.8 實(shí)際血漿樣本中亞甲藍(lán)殘留量檢測(cè)

        取20份待測(cè)血漿,按“2.1”項(xiàng)方法對(duì)每份血漿配制3個(gè)平行待測(cè)溶液,測(cè)定熒光強(qiáng)度。以空白溶液3次測(cè)定的平均熒光強(qiáng)度為標(biāo)準(zhǔn),計(jì)算ΔF。按回歸方程計(jì)算相應(yīng)的亞甲藍(lán)殘留量,(見(jiàn)表2)。結(jié)果表明,20個(gè)實(shí)際血漿樣本中亞甲藍(lán)的含量均在線性范圍內(nèi),且低于最大規(guī)定殘留量0.2 μmol/L。由此說(shuō)明本方法對(duì)于實(shí)際的成品血漿能夠?qū)崿F(xiàn)亞甲藍(lán)殘留量的準(zhǔn)確檢測(cè),并表現(xiàn)出快速、簡(jiǎn)單、低血漿消耗的顯著特點(diǎn)。而基于β-環(huán)糊精的熒光分光光度法[7],最低定量限為0.089 μmol/L,20個(gè)實(shí)際血漿樣本中僅有8個(gè)樣本亞甲基藍(lán)濃度在線性范圍內(nèi),因此用這種方法僅有40%的實(shí)際樣本能得到準(zhǔn)確檢測(cè)。

        表2 實(shí)際血漿樣本中亞甲藍(lán)殘留量Tab 2 The residual quantity of methylene blue in actual plasma sample

        3 討論

        3.1 羧甲基-β-環(huán)糊精對(duì)亞甲藍(lán)熒光的增敏作用

        由于β-環(huán)糊精與亞甲藍(lán)能夠形成超分子包合物而增強(qiáng)亞甲藍(lán)的熒光強(qiáng)度,據(jù)此已經(jīng)建立亞甲藍(lán)的增敏熒光法[7]。β-環(huán)糊精與亞甲藍(lán)形成包合物的驅(qū)動(dòng)力主要是疏水作用力[8],而陰離子型的羧甲基-β-環(huán)糊精與陽(yáng)離子型的亞甲藍(lán)之間的相互作用,除了疏水作用力外,還存在靜電相互作用,這種較強(qiáng)的作用力預(yù)示著對(duì)亞甲藍(lán)的增敏作用將更為顯著。從圖2可見(jiàn),PBS緩沖溶液和羧甲基-β-環(huán)糊精對(duì)空白血漿的基底熒光沒(méi)有顯著影響,其強(qiáng)度均近乎為0(曲線a和b);然而,羧甲基-β-環(huán)糊精對(duì)亞甲藍(lán)的熒光確表現(xiàn)出了顯著的增強(qiáng)作用,為84%(曲線c和d)。相對(duì)于β-環(huán)糊精的增敏作用[7],羧甲基-β-環(huán)糊精的熒光增強(qiáng)使本文建立方法的靈敏度獲得了進(jìn)一步提高(約為前者的10倍)。

        圖2 羧甲基-β-環(huán)糊精對(duì)亞甲藍(lán)熒光的增敏作用a.空白血漿和 PBS;b.空白血漿+羧甲基-β-環(huán)糊精;c.空白血漿、亞甲藍(lán)+PBS;d.空白血漿、亞甲藍(lán)+羧甲基-β-環(huán)糊精)Fig 2 Sensitizing effect of CM-β-CD on the fluorescence signal of methylene blueA.blank plasma and PBS;B.blank plasma and CM-β-CD;C.blank plasma,methylene blue and PBS;D.blank plasma,methylene blue and CM-β-CD

        3.2 羧甲基-β-環(huán)糊精濃度的影響

        在含相同濃度亞甲藍(lán)的血漿樣本中,加入不同濃度的羧甲基-β-環(huán)糊精飽和溶液,使其濃度在0~5 mmol/L范圍內(nèi),測(cè)定其熒光強(qiáng)度(見(jiàn)圖3)。結(jié)果當(dāng)羧甲基-β-環(huán)糊精濃度較低時(shí),隨著其濃度的增加,亞甲藍(lán)熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng);當(dāng)血漿中羧甲基-β-環(huán)糊精的濃度為4.5 mmol/L時(shí),熒光強(qiáng)度最高,表明較高濃度的亞甲藍(lán)已經(jīng)被羧甲基-β-環(huán)糊精完全包合;繼續(xù)增加羧甲基-β-環(huán)糊精,熒光反而有所下降。因此,優(yōu)化的羧甲基-β-環(huán)糊精濃度為4.5 mmol/L。

        4 結(jié)語(yǔ)[8]

        圖3 羧甲基-β-環(huán)糊精濃度對(duì)亞甲藍(lán)熒光強(qiáng)度的影響Fig 3 The influence of CM-β-CD on the fluorescence intensity of methylene blue

        本文基于羧甲基-β-環(huán)糊精超分子包合物熒光光度法,建立了靈敏檢測(cè)血漿中殘留亞甲藍(lán)的方法。結(jié)果證明,該方法準(zhǔn)確可靠,不需分離富集,檢測(cè)所需血漿量較少,可用于血漿中殘留亞甲藍(lán)的快速檢測(cè);且相對(duì)于β-環(huán)糊精的增敏作用[7],羧甲基-β-環(huán)糊精的熒光增強(qiáng)使本文建立方法的靈敏度約為前者的10倍。

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