周群剛，謝蓮，方敏，趙銘，唐建華，王明元，徐軍，謝洪平#（.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，江蘇蘇州 53；.蘇州市中心血站，江蘇蘇州 5006）

為降低臨床上輸血感染病毒的風(fēng)險(xiǎn)，增加輸血的安全性，一般采用亞甲藍(lán)光化學(xué)法滅活血漿中的病毒[1]。在滅活病毒以后，需使用特制的濾器濾除85%以上的亞甲藍(lán)[2]，最大殘留量為0.2 μmol/L。為了保證用血安全，需要對血漿中亞甲藍(lán)的殘留量進(jìn)行檢測。測定方法有化學(xué)發(fā)光法[3]、高效液相色譜法[4]及共振瑞利散射法[5]等，這些方法中，有的靈敏度較低，有的需采用固相萃取富集后才能測定。在原衛(wèi)生部編制的《血站技術(shù)操作規(guī)程（2012年版）》[6]中，利用小柱萃取富集預(yù)處理后以分光光度法檢測。但是，該方法檢測靈敏度仍然較低，大多數(shù)樣本的吸光度在《中國藥典》（2010年版）附錄方法所規(guī)定的0.3以下，預(yù)示著檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。同時(shí)，該方法不但操作繁瑣，而且需要大量的血漿，浪費(fèi)寶貴的血漿資源。周群剛等[7]利用電中性的β-環(huán)糊精發(fā)展了一種亞甲藍(lán)增敏熒光分光光度法，以提高檢測靈敏度，實(shí)現(xiàn)了不經(jīng)分離、富集直接測定血漿中亞甲藍(lán)，表現(xiàn)出了快速、簡單、需要血漿量少的優(yōu)點(diǎn)。但是，該方法的最低定量限（0.089 μmol/L）與血漿中最大殘留量0.2 μmol/L非常接近，前者僅僅為后者的0.46倍，預(yù)示著該方法存在兩個(gè)問題：（1）檢測信號的絕對值較低，導(dǎo)致該方法對于大多數(shù)的實(shí)際檢測樣本的信噪比低；（2）樣本的實(shí)際殘留量極有可能低于該定量限，從而導(dǎo)致該方法不能用于有些實(shí)際樣本的檢測。本文利用陰離子型環(huán)糊精對亞甲藍(lán)熒光的增敏作用，建立了一種新的檢測血漿中殘留亞甲藍(lán)的方法。與之前方法相比該方法檢測限低、靈敏度高、操作簡便，具有一定的創(chuàng)新性和應(yīng)用價(jià)值。

1 材料

1.1 儀器

LS-55熒光分光光度計(jì)（美國Perkin Elmer公司）。

1.2 藥品與試劑

亞甲藍(lán)（上海TCI公司，純度＞98.5%）；羧甲基-β-環(huán)糊精（山東濱州智源生物科技有限公司，純度＞98%）；其他試劑均為分析純。蘇州市中心血站提供8份非滅活混合人血漿約1000 ml，使用一次性病毒滅活配套裝置中的過濾器濾除白細(xì)胞，得不含亞甲藍(lán)的血漿，即空白血漿；同時(shí)提供20份經(jīng)亞甲藍(lán)病毒滅活的成品血漿樣本，即待測血漿。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

稱取亞甲藍(lán)0.0745 g，置于100 ml量瓶中，用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2）溶解并稀釋至刻度。準(zhǔn)確量取5.00ml，用PBS定容到100 ml，得貯備液（100μmol/L），避光、密封保存。

2.2 血漿樣品的制備

向420μl的待測血漿中加入344μl的羧甲基-β-環(huán)糊精飽和溶液（0.01 mol/L），使羧甲基-β-環(huán)糊精濃度為4.5 mmol/L，充分混勻，避光放置20 min，即得待測溶液。同時(shí)，用空白血漿按前述方法配制不含亞甲藍(lán)的待測溶液，即得空白溶液。

2.3 熒光分光光度法測定血漿中亞甲藍(lán)含量

將待測溶液（或空白溶液）置于熒光比色皿中，以665 nm為激發(fā)波長、680 nm為發(fā)射波長、激發(fā)狹縫寬度5 nm、發(fā)射狹縫寬度5 nm、激發(fā)光程2 mm、發(fā)射光程10 mm，測定其熒光強(qiáng)度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算亞甲藍(lán)含量。

2.4 線性關(guān)系考察

用亞甲藍(lán)貯備液和空白血漿分別配制含亞甲藍(lán)濃度為0.008、0.05、0.08、0.15、0.20μmol/L的5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)血漿。利用羧甲基-β-環(huán)糊精溶液（0.01 mol/L），按“2.1”項(xiàng)下方法配制標(biāo)準(zhǔn)待測溶液，再按“2.3”項(xiàng)下方法測定標(biāo)準(zhǔn)待測溶液的熒光強(qiáng)度。以扣除空白的待測溶液的熒光強(qiáng)度為依據(jù)，即ΔF＝F－F0（其中，F(xiàn)和F0分別為待測溶液和空白溶液的熒光強(qiáng)度），對相應(yīng)的亞甲藍(lán)濃度（c）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為ΔF＝73.898 c－0.0734（r＝0.9990）。結(jié)果表明，亞甲藍(lán)血藥濃度在0.008～0.2μmol/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 包合反應(yīng)時(shí)間

對于含亞甲藍(lán)相同濃度的6個(gè)樣本，室溫避光，經(jīng)不同包合反應(yīng)時(shí)間后，測定其熒光強(qiáng)度（見圖1）。從圖1可知，室溫下反應(yīng)20 min后體系熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定，20、40、60、120 min熒光強(qiáng)度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.57%，熒光至少穩(wěn)定2h。因此本試驗(yàn)采用反應(yīng)20 min后測定。

圖1 亞甲藍(lán)熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化Fig 1 Change of fluorescence intensity of methylene blue with time

2.6 精密度試驗(yàn)

利用空白血漿和亞甲藍(lán)貯備液，按“2.1”項(xiàng)下方法配制含亞甲藍(lán)0.2、0.08、0.008 μmol/L的3個(gè)高、中、低濃度的待測溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法測定其熒光強(qiáng)度。對同一個(gè)樣本在同一天內(nèi)測定11次，以測得的熒光強(qiáng)度計(jì)算日內(nèi)RSD；對同一個(gè)樣本連續(xù)測定11 d，以測得的熒光強(qiáng)度計(jì)算日間RSD。結(jié)果表明，該方法具有良好的精密度，結(jié)果見表1。

表1 精密度及回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Results of precision and recovery tests

2.7 回收率試驗(yàn)

利用空白血漿和亞甲藍(lán)貯備液，按“2.1”方法分別配制含亞甲藍(lán)0.2、0.08、0.008 μmol/L的3個(gè)高、中、低濃度的待測溶液，按“2.3”項(xiàng)方法測定其熒光強(qiáng)度。以每個(gè)樣本連續(xù)測定5次的熒光強(qiáng)度的平均值按“2.4”項(xiàng)下回歸方程計(jì)算亞甲藍(lán)濃度，并據(jù)此計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。該結(jié)果表明本文所建立的方法具有良好的回收率。

2.8 實(shí)際血漿樣本中亞甲藍(lán)殘留量檢測

取20份待測血漿，按“2.1”項(xiàng)方法對每份血漿配制3個(gè)平行待測溶液，測定熒光強(qiáng)度。以空白溶液3次測定的平均熒光強(qiáng)度為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算ΔF。按回歸方程計(jì)算相應(yīng)的亞甲藍(lán)殘留量，（見表2）。結(jié)果表明，20個(gè)實(shí)際血漿樣本中亞甲藍(lán)的含量均在線性范圍內(nèi)，且低于最大規(guī)定殘留量0.2 μmol/L。由此說明本方法對于實(shí)際的成品血漿能夠?qū)崿F(xiàn)亞甲藍(lán)殘留量的準(zhǔn)確檢測，并表現(xiàn)出快速、簡單、低血漿消耗的顯著特點(diǎn)。而基于β-環(huán)糊精的熒光分光光度法[7]，最低定量限為0.089 μmol/L，20個(gè)實(shí)際血漿樣本中僅有8個(gè)樣本亞甲基藍(lán)濃度在線性范圍內(nèi)，因此用這種方法僅有40%的實(shí)際樣本能得到準(zhǔn)確檢測。

表2 實(shí)際血漿樣本中亞甲藍(lán)殘留量Tab 2 The residual quantity of methylene blue in actual plasma sample

3 討論

3.1 羧甲基-β-環(huán)糊精對亞甲藍(lán)熒光的增敏作用

由于β-環(huán)糊精與亞甲藍(lán)能夠形成超分子包合物而增強(qiáng)亞甲藍(lán)的熒光強(qiáng)度，據(jù)此已經(jīng)建立亞甲藍(lán)的增敏熒光法[7]。β-環(huán)糊精與亞甲藍(lán)形成包合物的驅(qū)動力主要是疏水作用力[8]，而陰離子型的羧甲基-β-環(huán)糊精與陽離子型的亞甲藍(lán)之間的相互作用，除了疏水作用力外，還存在靜電相互作用，這種較強(qiáng)的作用力預(yù)示著對亞甲藍(lán)的增敏作用將更為顯著。從圖2可見，PBS緩沖溶液和羧甲基-β-環(huán)糊精對空白血漿的基底熒光沒有顯著影響，其強(qiáng)度均近乎為0（曲線a和b）；然而，羧甲基-β-環(huán)糊精對亞甲藍(lán)的熒光確表現(xiàn)出了顯著的增強(qiáng)作用，為84%（曲線c和d）。相對于β-環(huán)糊精的增敏作用[7]，羧甲基-β-環(huán)糊精的熒光增強(qiáng)使本文建立方法的靈敏度獲得了進(jìn)一步提高（約為前者的10倍）。

圖2 羧甲基-β-環(huán)糊精對亞甲藍(lán)熒光的增敏作用a.空白血漿和 PBS；b.空白血漿+羧甲基-β-環(huán)糊精；c.空白血漿、亞甲藍(lán)+PBS；d.空白血漿、亞甲藍(lán)+羧甲基-β-環(huán)糊精）Fig 2 Sensitizing effect of CM-β-CD on the fluorescence signal of methylene blueA.blank plasma and PBS；B.blank plasma and CM-β-CD；C.blank plasma，methylene blue and PBS；D.blank plasma，methylene blue and CM-β-CD

3.2 羧甲基-β-環(huán)糊精濃度的影響

在含相同濃度亞甲藍(lán)的血漿樣本中，加入不同濃度的羧甲基-β-環(huán)糊精飽和溶液，使其濃度在0～5 mmol/L范圍內(nèi)，測定其熒光強(qiáng)度（見圖3）。結(jié)果當(dāng)羧甲基-β-環(huán)糊精濃度較低時(shí)，隨著其濃度的增加，亞甲藍(lán)熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)；當(dāng)血漿中羧甲基-β-環(huán)糊精的濃度為4.5 mmol/L時(shí)，熒光強(qiáng)度最高，表明較高濃度的亞甲藍(lán)已經(jīng)被羧甲基-β-環(huán)糊精完全包合；繼續(xù)增加羧甲基-β-環(huán)糊精，熒光反而有所下降。因此，優(yōu)化的羧甲基-β-環(huán)糊精濃度為4.5 mmol/L。

4 結(jié)語[8]

圖3 羧甲基-β-環(huán)糊精濃度對亞甲藍(lán)熒光強(qiáng)度的影響Fig 3 The influence of CM-β-CD on the fluorescence intensity of methylene blue

本文基于羧甲基-β-環(huán)糊精超分子包合物熒光光度法，建立了靈敏檢測血漿中殘留亞甲藍(lán)的方法。結(jié)果證明，該方法準(zhǔn)確可靠，不需分離富集，檢測所需血漿量較少，可用于血漿中殘留亞甲藍(lán)的快速檢測；且相對于β-環(huán)糊精的增敏作用[7]，羧甲基-β-環(huán)糊精的熒光增強(qiáng)使本文建立方法的靈敏度約為前者的10倍。

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