陳 娟 張景燕 王 蓉 趙靜姝 郭 瑾 王玉蘭 張 旭

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室 北京老年病醫(yī)療研究中心 神經(jīng)變性病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100053)

熱量限制(CR)是指有計(jì)劃的減少由食物提供的熱量，一般是在保證足夠的維生素和礦物質(zhì)水平下，將正常自由進(jìn)食所得的熱量減去30% ～50%〔1〕。老年癡呆成為威脅人類健康的主要疾病之一。研究表明，CR具有提高認(rèn)知及記憶能力、延緩?fù)诵行约膊〉陌l(fā)生及發(fā)展、延緩衰老等有利作用，其中，抗氧化應(yīng)激損傷是作用機(jī)制之一〔2〕。目前，用于體內(nèi)研究的CR方法有很多，如減少食物中脂類、糖類物質(zhì)的比例，也有用藥物干預(yù)如白藜蘆醇等〔3〕。本實(shí)驗(yàn)旨在通過降低培養(yǎng)液中細(xì)胞的主要能量消耗來源葡萄糖的方式和白藜蘆醇模擬CR作用，建立SH-SY5Y細(xì)胞CR模型，對(duì)比兩種方法對(duì) H2O2誘導(dǎo)的 SHSY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)效果。

1 材料和方法

1.1 材料 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤株SH-SY5Y細(xì)胞來自瑞典卡羅林斯卡醫(yī)學(xué)院。噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自Sigma公司，二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自北京亞太精細(xì)化工公司，乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京化工廠，編號(hào)001012，30%H2O2購(gòu)自北京化工試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 細(xì)胞用DMEM×F12(Gibco)培養(yǎng)基培養(yǎng)(3.0 g/L-葡萄糖)，加入10%胎牛血清、青霉素100 IU/ml、鏈霉素100 IU/ml于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到70% ～80%時(shí)，分組處理:對(duì)照組及損傷組，DMEM×F12(3.0 g/L-葡萄糖)加入1%胎牛血清，培養(yǎng)24 h;低糖組及低糖+損傷組，換用低糖組培養(yǎng)基為DMEM(2.0 g/L-葡萄糖)加1%胎牛血清，培養(yǎng)24 h;白藜蘆醇組和白藜蘆醇+損傷組，換用DMEM×F12(3.0 g/L-葡萄糖)加入1%胎牛血清及不同濃度的白藜蘆醇，培養(yǎng)24 h;預(yù)處理后予以250 μmol/L的H2O2分別損傷1 h和7 h。用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT代謝率測(cè)定 將SH-SY5Y細(xì)胞接種于96孔板中，細(xì)胞接種密度1.0×104/孔，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至70% ～80%時(shí)予以相應(yīng)處理，加入MTT溶液(5.0 g/L)20 μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO作用10 min后，用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Multiskan Spectrum)測(cè)定570 nm處光密度值。

1.2.3 細(xì)胞形態(tài)觀察 將SH-SY5Y細(xì)胞以2×102/ml接種于6孔板(Costar產(chǎn)品)中，分為對(duì)照組(3.0 g/L-葡萄糖)、損傷組(250 μmol/L H2O2)、低糖組(2.0 g/L-葡萄糖)、低糖+損傷組、白藜蘆醇(1.25、5 μmol/L)組、白藜蘆醇(1.25 μmol/L)+損傷組，處理方式同前，用倒置顯微鏡(Olympus產(chǎn)品)觀察細(xì)胞形態(tài)的改變。

1.2.4 LDH漏出率測(cè)定 細(xì)胞培養(yǎng)方法同前，按照比色法，測(cè)定570 nm處光密度值，同時(shí)做表。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS11.5軟件統(tǒng)計(jì)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 MTT代謝率測(cè)定 對(duì)照組細(xì)胞活力為(0.762±0.016)，用低糖和白藜蘆醇預(yù)處理細(xì)胞24 h，低糖組細(xì)胞活力上升(0.847±0.013，P ＜0.01);白藜蘆醇1.25 μmol/L 組活力稍上升，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(0.768±0.016，P＞0.05);白藜蘆醇5 μmol/L組活力下降(0.685 ±0.019)。用250 μmol/L H2O2分別處理1 h和7 h，低糖+損傷組在1 h和7 h活力都上升;而白藜蘆醇+損傷組在損傷1 h時(shí)活力上升，但是在作用7 h后活力明顯下降。見表1。

2.2 LDH漏出率測(cè)定結(jié)果 損傷1 h后結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，損傷組漏出率明顯增加(1.368±0.101 vs 1.249±0.079，P＜0.05)，低糖組、白藜蘆醇組漏出率稍有減少，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(1.163±0.052，1.198±0.071，P ＞0.05);與損傷組比較，低糖+損傷組漏出率明顯減少(1.143±0.047，P＜0.01)，白藜蘆醇+損傷組漏出率減少(1.251±0.067，P＜0.05)。繼續(xù)培養(yǎng)至7 h顯示，低糖組漏出率由增加至(1.223±0.107)，增加了5%;低糖+損傷組漏出率增加至(1.262±0.081)，增加了11%;白藜蘆醇+損傷組由顯著增加至(1.863±0.165)，增加了48%(P＜0.01);白藜蘆醇+損傷組漏出率高于低糖+損傷組(P＜0.01)。

2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 未加損傷之前，低糖組細(xì)胞形態(tài)，與空白組比較無明顯改變，加入損傷藥物1 h后，各組細(xì)胞形態(tài)與空白組比較無明顯改變，加入7 h后，低糖組、低糖組+損傷組和空白組。細(xì)胞突起伸展良好細(xì)長(zhǎng)，白藜蘆醇+損傷組可見細(xì)胞數(shù)目明顯減少，死細(xì)胞多，細(xì)胞突起回縮，細(xì)胞明顯變圓，貼壁性不好，透光性差。見圖1。

表1 用250 μmol/L H2O2分別處理1 h和7 h各組細(xì)胞活力(s)

表1 用250 μmol/L H2O2分別處理1 h和7 h各組細(xì)胞活力(s)

與對(duì)照組及損傷組比較:1)P＜0.01

0.302 2±0.001 0.537 2±0.007損傷組 0.204 8±0.003 0.147 7±0.001低糖組 0.446 4±0.0081) 0.582 7±0.0061)低糖+損傷組 0.448 4±0.0061) 0.568 8±0.0031)白藜蘆醇+損傷組 0.208 9±0.0061) 0.156 2±0.0021)1 h 7 h對(duì)照組分組

圖1 各組細(xì)胞形態(tài)(×3 000)

3 討論

與疾病有關(guān)的危險(xiǎn)因子，如高熱量飲食、維生素缺乏(如葉酸和抗氧化劑)等，也與阿爾茨海默病、帕金森綜合征等神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)〔4〕。CR抗氧化應(yīng)激損傷延緩衰老的可能機(jī)制之一是通過SIRT1介導(dǎo)的〔5〕。而白藜蘆醇作為SIRT1的激動(dòng)劑，用于模擬CR模型的體外研究也很多。SH-SY5Y細(xì)胞來源于神經(jīng)母細(xì)胞瘤，其細(xì)胞形態(tài)及生理，生化功能與正常神經(jīng)元相似，已經(jīng)廣泛用于神經(jīng)生物學(xué)研究〔6〕。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇只對(duì)急性期的氧化應(yīng)激損傷起保護(hù)作用，對(duì)于長(zhǎng)期的氧化應(yīng)激損傷，白藜蘆醇顯示一定的毒性反應(yīng)。這一結(jié)論提示在CR或氧化逆境條件下，可能增加了細(xì)胞內(nèi)的SIRT1蛋白的表達(dá)，通過抑制PPAR2r減少細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化的損傷〔7〕;調(diào)控 P53 的活性影響細(xì)胞的壽命〔8〕;調(diào)控FOXO的信號(hào)通路，啟動(dòng)細(xì)胞的抗氧化途徑〔9，10〕。近年對(duì)白藜蘆醇的研究顯示，白藜蘆醇在心腦血管疾病、內(nèi)分泌疾病、腫瘤等方面都發(fā)揮了很好的作用，也有人把它作為CR的代用品，然而，目前對(duì)白藜蘆醇在使用上也存在些問題，如:治療劑量還很不一致，使用大劑量白藜蘆醇顯示一定的毒性反應(yīng)〔10〕，與本實(shí)驗(yàn)中的觀察結(jié)果一致，而且白藜蘆醇吸收入血后的半衰期短，不便于臨床的使用。因此，低糖處理更能模擬CR的體外模型。

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