直 強 蔣春煥 孫筱倩 (鶴壁京立腫瘤醫(yī)院內(nèi)科，河南 鶴壁 458030)

冠狀動脈疾病(CAD)是血管腔阻塞和血管內(nèi)壁炎癥之間相互作用所致〔1〕，存在于動脈粥樣病變中T細(xì)胞特別是其發(fā)揮致動脈硬化和斑塊失穩(wěn)定作用而導(dǎo)致病變惡化〔2〕。但是，CAD的炎癥途徑活化并不僅限于CAD灶而且包括刺激循環(huán)性單信心細(xì)胞和淋巴細(xì)胞〔3〕。T淋巴細(xì)胞分化為T輔助(Th)1和Th2亞群，具有不同的特征性細(xì)胞因子表達、黏附機制、效應(yīng)器作用形式、心臟局部免疫反應(yīng)。Th1細(xì)胞表達獨特的細(xì)胞因子屬性，包括干擾素(IFN)-γ、腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-2;Th2細(xì)胞主要分泌IL-4和IL-10〔4〕。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活(STAT)因子家族調(diào)節(jié)Th1和Th2細(xì)胞分化。有推測認(rèn)為STAT4控制IL-12介導(dǎo)Th1分化，而STAT6控制IL-4引發(fā)Th2發(fā)生〔5〕。穩(wěn)定性心絞痛(SA)、急性冠狀動脈綜合征(ACS)、進展性心肌梗死(STEMI)，心肌梗死而完全無癥狀及未確定心肌梗死(UH)之間的區(qū)別仍然存在問題。前期研究表明ACS和UH患者之間存在不同的免疫活性形式〔5，6〕，T細(xì)胞活性形式的差異并不明顯。本研究旨在觀察SA和ACS及健康對照組間循環(huán)T細(xì)胞的活性特征。

1 材料和方法

1.1 研究對象 65例住院病人診斷為CAD納入研究。入院后盡快采集靜脈血標(biāo)本，C-反應(yīng)蛋白(CRP)、白細(xì)胞計數(shù)、膽固醇、血糖、肌鈣蛋白-Ⅰ、肌酸激酶(CK)等均按照常規(guī)方法檢測。病人分組見表1示。18例患者符合加拿大心血管協(xié)會分級Ⅱ和ⅢSA(組Ⅰ)并至少有1處冠狀動脈狹窄(血管造影證實狹窄達50%以上);28例診斷為ACS并入住心血管內(nèi)科監(jiān)護室(CCU)，以持續(xù)性胸痛在6 h內(nèi)入院;其中16例(組Ⅱ)屬于BraunwaldⅡ或Ⅲ級，表現(xiàn)為一過性ST段壓低和(或)T波倒置但無心肌梗死證據(jù)。12例ACS患者呈現(xiàn)STEMI(組Ⅲ)，CK水平上升(394 U，297～521 U)，心肌蛋白Ⅰ上升(87 ng/ml，34～123 ng/ml)。19例病人發(fā)生持續(xù)性胸痛6 h，伴ST-段抬高和CK(392 U/L，213～629 U/L)與心肌鈣蛋白Ⅰ(79 ng/ml，14 ～187 ng/ml)增高，無缺血性心臟病病史或慢性SA病史或急性事件、或最近6個月內(nèi)癥狀惡化，這些病人為組 Ⅳ(UH)。STEMI和UH確定文獻〔5〕。所有病人住院后均進行血管造影檢查。排除標(biāo)準(zhǔn):6個月內(nèi)心肌梗死;癥狀發(fā)生后6 h以上住院;急性炎癥疾病;自身免疫疾病;腫瘤。組V為16例健康成人，這些人具有正常的心電圖表現(xiàn)，超聲心動圖檢查無明顯異常，無動脈粥樣硬化證據(jù)。

1.2 CD4+T淋巴細(xì)胞分離、mRNA分離、半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)單核細(xì)胞分離從肝素化血標(biāo)本由聚蔗糖密度梯度離心分離，分離后的單核細(xì)胞應(yīng)用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌2次并重新在PBS中懸浮得到107細(xì)胞/ml。CD4+T淋巴細(xì)胞應(yīng)用MACS-CD4+磁性細(xì)胞分離珠分離，mRNA分離采用(Dynal，Oslo，Norway)和 cDNA 合成參照文獻〔7〕。

1.3 細(xì)胞染色和流式細(xì)胞儀檢測 肝素化全血應(yīng)用RPMI1640 稀釋(1∶1)，應(yīng)用 1 μg/ml佛波酯和50 μg/ml離子霉素加入500 μg/ml的布雷菲德菌素 A(均為 Sigma-Aldrich，Poole，United Kingdom)刺激細(xì)胞，標(biāo)本在37℃ 5%CO2條件下培育4 h，以最大限度活化T細(xì)胞和積聚細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子〔8〕。刺激和未刺激(僅用 Brefeldin A)樣本應(yīng)用CD3-PerCP a抗體(mouse IgG1 anti-human，clone SK7，Pharmingen，San Jose，California)在室溫下染色15 min。紅細(xì)胞溶解采用熒光激活細(xì)胞分類(FACS)細(xì)胞溶解緩沖液(BDIS，San Jose，California)。淋巴細(xì)胞應(yīng)用PBS 0.5%牛血清白蛋白及0.1%疊氮化鈉洗滌，此后在FACS通透液BDIS培育10 min，然后將細(xì)胞洗滌2次并用IFN-γ-熒光素異硫氰酸鹽(mouse IgG 2b anti-human，clone 25723.11)和 IL-4-藻紅蛋白 (mouse IgG1 anti-human，clone 3010.211)抗體(或IgG 2b熒光素異硫氰酸鹽IgG1藻紅蛋白同型對照，均為Pharmingen產(chǎn)品)在室溫下染色30 min。最后將樣本洗滌1次，然后重懸于1%的多聚甲醛PBS，以進行流式細(xì)胞分析(BDIS)。檢測CD3+T細(xì)胞亞群和細(xì)胞因子IL-2及IFN-γ水平及STAT 4 mRNA水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用JMP統(tǒng)計軟件(SAS Institute Inc，Cary，North Carolina)，piro-Wilk檢驗用于確定 數(shù)值是否符合正態(tài)分布，不符合正態(tài)分布，兩組間比較應(yīng)用Wilcoxon檢驗，多組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗。連續(xù)變量比較應(yīng)用t檢驗，分級變量比較采用χ2檢驗。CRP、低密度脂蛋白膽固醇、心肌鈣蛋白I及CK值以中位值和范圍值表達，其他變量以s表示或數(shù)值(%)。Spearman相關(guān)確定mRNA轉(zhuǎn)錄水平和IFN-γ-生成T細(xì)胞數(shù)量之間的相對關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 病人特征 SA、ACS、UH病人組間比較年齡、性別、血脂或血糖、吸煙情況或藥物應(yīng)用無顯著差異。ACS或UH病人組CAD病變更重，見表1。

表1 一般資料(s)

表1 一般資料(s)

與 STEMI和 UH比較:1)P＜0.01;2)P＜0.05

?

2.2 IFN-γ和IL-4生成T細(xì)胞頻數(shù)評估 SA和UH組與對照組比較T細(xì)胞活性分別較對照值增高1.9和1.7倍，雖然僅SA組病人達到統(tǒng)計學(xué)顯著性(P＜0.01)。冠心病癥狀不穩(wěn)定與增高的 IFN-γ+/CD3+表達相關(guān)，ACS病人組較對照值增高4.6倍，SA組增高2.4倍，UH組增高2.7倍(P＜0.001)。UA組和STEMI組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.68)，高水平的肌鈣蛋白和低水平的肌鈣蛋白患者比較差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.53)。相反，循環(huán)性 Th2細(xì)胞(IL4+/CD3+群)或 Th0細(xì)胞(IL4+/IFN-γ+/CD3+群)級間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 Th0、Th1及Th2細(xì)胞因子和STAT4和STAT6轉(zhuǎn)錄水平應(yīng)用RT-PCR擴增后應(yīng)用FACS分析mRNA的表達。Th1信號轉(zhuǎn)換STAT4轉(zhuǎn)錄水平在UA〔(1.3±0.2)U，P＜0.01〕及 STEMI〔(1.4±0.3)U，P＜0.01〕均較其他組高〔對照組(0.5±0.1)U;SA組(0.7±0.3)U;UH組(0.6±0.1)U〕。SA組和UH組患者與對照組比較STAT4的mRNA水平增高，但僅SA組患者達到統(tǒng)計學(xué)顯著水平(P＜0.05)。相似的結(jié)果也見于Th1標(biāo)記細(xì)胞因子IL-2和 IFN-γ，UA 組和 STEMI組 IL-2 mRNA(1.5±0.3)及(1.4±0.2)比 SA、UH組及對照組 mRNA轉(zhuǎn)錄水平增高〔(0.7±0.2)、(0.5±0.1)、(0.3±0.1)，P ＜0.01〕。對照組、SA組、UA組、STEMI組與UH組IFN-γ轉(zhuǎn)錄水平分別為(0.3±0.2)、(0.5±0.2)、(1.3±0.3)、(1.4 ±0.5)及(0.5 ±0.1)，SA和UH組患者IL-2和IFN-γ水平比對照組增高，僅SA組患者達到統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。見圖1。Th2信號轉(zhuǎn)換STAT6相對轉(zhuǎn)錄水平、Th2標(biāo)記細(xì)胞因子IL-4和IL-10各級之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。循環(huán)性IFN-γ+/CD3+淋巴細(xì)胞和IFN-γ的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平(r=0.68，P ＜0.01)、STAT4(r=0.88，P ＜0.001)之間各組均呈強相關(guān)。

3 討論

眾多的證據(jù)表明，不穩(wěn)定的動脈粥樣硬化病變與全身免疫活性相關(guān)〔3，6，9，10〕。本研究結(jié)果提示 2 個重要發(fā)現(xiàn):其一，雖然穩(wěn)定性CAD病人和ACS病人具有相似的CAD病變，但ACS病人顯示循環(huán)性活化CD3+T細(xì)胞擴張，其表現(xiàn)型以Th1淋巴細(xì)胞為主。患者的Th1細(xì)胞活性增強，在心肌損害前即可觀察到，在STEMI患者仍然呈增高表現(xiàn)。其次，UH患者有更重的動脈粥樣硬化病變負(fù)擔(dān)，他們的冠狀動脈阻塞程度亦重，而T細(xì)胞活性水平與SA患者相當(dāng)。

本研究結(jié)果與以往報道發(fā)現(xiàn)炎癥刺激、阻塞性病變相一致，可出現(xiàn)于整個冠狀動脈粥樣硬化過程中〔11〕，UA患者可呈現(xiàn)時間依賴性的免疫系統(tǒng)活化〔2，10〕。急性炎癥在UA患者的存在，受到其他臨床研究結(jié)果支持，這些研究證實非特異性炎癥標(biāo)記物、ILs和 IFN-γ、活化 T淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞增高〔3～5，10，11〕。體外的動物研究對 Th1 驅(qū)動的免疫反應(yīng)在動脈粥樣硬化中的重要性進行重點觀察。來自動脈粥樣硬化供體的CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)接到免疫缺陷鼠則加重了動脈粥樣硬化進程。反之，T細(xì)胞轉(zhuǎn)移伴有增強的全身IFN-γ水平〔12〕。此外，鼠發(fā)生動脈粥樣硬化病變可受到Th1藥物阻斷的抑制，通過IL-10刺激Th2分化對抗Th1分化也可抑制這一病變過程〔11，12〕。而且，來自冠心病患者的資料顯示周圍循環(huán)性T細(xì)胞隨著臨床明顯的動脈粥樣硬化病變時間發(fā)生變化，痙攣性心絞痛病人顯示以 Th1 反應(yīng)占優(yōu)勢〔3，13〕。

兩種T細(xì)胞亞群的信號因子程序(STAT4和STAT6)和CAD不同階段之間的關(guān)系的報道極少。本研究發(fā)現(xiàn)可進一步證明Th1細(xì)胞的活性在CAD演變的整個過程中都是增強的。以往研究顯示，定向性降低轉(zhuǎn)錄因子STAT4導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因鼠心臟移植物血管病變減弱〔14〕。本研究結(jié)果顯示SA和ACS與外周循環(huán)T細(xì)胞的STAT4轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)相關(guān)。Th1細(xì)胞活化的程度在UH患者較ACS患者明顯要低。UH患者更可能呈現(xiàn)為多支血管病變，其梗死相關(guān)血管的狹窄程度亦較ACS患者更顯著。冠狀動脈狹窄和IFN-γ-CD3+T細(xì)胞頻數(shù)之間缺少關(guān)聯(lián)已經(jīng)得到證明〔11〕，人體動脈斑塊T細(xì)胞的數(shù)量與整個斑塊的形態(tài)學(xué)相關(guān)，更穩(wěn)定的纖維斑塊中T細(xì)胞數(shù)量低而易破裂斑塊中T細(xì)胞數(shù)量高。T細(xì)胞積聚在病灶的肩區(qū)，此區(qū)通常是最厚的頂部，炎癥細(xì)胞浸潤最嚴(yán)重，最容易發(fā)生破裂〔13〕。因此，T細(xì)胞活化可能不是患者固定性阻塞病變的驅(qū)動因素，而易受侵襲和易受影響的新陳代謝活躍斑塊的不穩(wěn)定性是更基本的原因。易受影響的斑塊特征性的組織形態(tài)學(xué)特征包括高脂含量、炎癥細(xì)胞數(shù)量增多、廣泛性新血管形成。T細(xì)胞通過吸引和活化白細(xì)胞與巨噬細(xì)胞而促進免疫反應(yīng)蔓延，此外，也與降低平滑肌細(xì)胞群、誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷、部分地由于IFN-γ誘導(dǎo)一氧化氮產(chǎn)物的調(diào)節(jié)異常等相關(guān)〔11～13〕?；罨疶細(xì)胞還抑制基質(zhì)合成，主要是通過IFN-γ生成和促使易受侵襲斑塊內(nèi)的凋亡過程〔14〕。因此，斑塊產(chǎn)生的非血流限制性狹窄似可解釋其較更嚴(yán)重狹窄呈現(xiàn)更多見的斑塊破裂和血栓形成。

總之，Th1膨脹與心肌損害指標(biāo)的短暫關(guān)系支持細(xì)胞免疫反應(yīng)活化和上調(diào)的免疫介質(zhì)對斑塊不穩(wěn)定性有影響。

1 Libby P，Ridker PM，Maseri A.Inflammation and atherosclerosis〔J〕.Circulation，2002;105(9):1135-43.

2 Woollard KJ，Geissmann F.Monocytes in atherosclerosis:subsets and functions〔J〕.Nat Rev Cardiol，2010;7(2):77-86.

3 Yan AT，Yan RT，Cushman M，et al.Relationship of interleukin-6 with regional and global left-ventricular function in asymptomatic individuals without clinical cardiovascular disease:insights from the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis〔J〕.Eur Heart J，2010;31(7):875-82.

4 姜 成，鄭良榮，張 丹，等.冠心病患者血清TNF-α、IL-1、IL-8、IL-12 的表達及臨床意義〔J〕.浙江醫(yī)學(xué)，2011;33(10):1433-5，1452.

5 Tousoulis D，Kampoli AM，Stefanadi E，et al.New biochemical markers in acute coronary syndromes〔J〕.Curr Med Chem，2008;15(13):1288-96.

6 Takeda K，Tanaka T，Shi W，et al.Essential role of Stat6 in IL-4 signalling〔J〕.Nature，1996;380(6575):627-30.

7 Picker LJ，Singh MK，Zdraveski Z，et al.Direct demonstration of cytokine synthesis heterogeneity among human memory/effector T cells by flow cytometry〔J〕.Blood，1995;86(4):1408-19.

8 王 露，金 媛.冠心病患者血清hs-CRP、IL-18和IL-1β檢測的臨床意義〔J〕.放射免疫學(xué)雜志，2009;22(5):543-4.

9 Wan JB，Lee SM，Wang J D，et al.Panax notoginseng reduces atherosclerotic lesions in ApoE-deficient mice and inhibits TNF-α-induced endothelial adhesion molecule expression and monocyte adhesion〔J〕.J Agric Food Chem，2009;57(15):6692-7.

10 薛 冰，李清賢，孫景芝.老年冠心病患者100例血清hs-CRP、IL-6和IL-18的檢測及臨床意義〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2010;30(7):997-8.

11 聶文成，傅國勝，陳祥新，等.IL-18、IL-10和IL-6與急性冠狀動脈綜合征的關(guān)系研究〔J〕.中國病理生理雜志，2005;21(5):886-8

12 陸衛(wèi)華，劉曉紅，來春林.冠心病患者血漿ET、TNF-α、IL-6及血小板參數(shù)的研究〔J〕.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2008;6(11):1347-8.

13 Soejima H，Irie A，Miyamoto S，et al.Preference toward a T-helper type 1 response in patients with coronary spastic angina〔J〕.Circulation，2003;107:2196-200.

14 Libby P.Changing concepts of atherogenesis〔J〕.J Intern Med，2000;247:349-58.