李延暉，張 蓉，鄒 練，楊云霜，瞿 彬，魏會(huì)珍，劉曉晨

(中國(guó)人民解放軍第二炮兵總醫(yī)院，北京100088)

隨著放射線在臨床中的廣泛應(yīng)用及核能在戰(zhàn)爭(zhēng)中逐漸凸顯的核心競(jìng)爭(zhēng)力［1］，輻射損傷的防治越來越不容忽視。文獻(xiàn)報(bào)道［2，3］，輻射對(duì)機(jī)體免疫、造血等系統(tǒng)有一定程度損傷，而生殖系統(tǒng)亦對(duì)輻射源敏感［4］。睪丸間質(zhì)細(xì)胞作為雄激素分泌細(xì)胞，是激發(fā)和調(diào)控男性生殖生理的特有細(xì)胞，具有合成和分泌雄激素的功能，與精子產(chǎn)生和成熟、生殖器官的發(fā)育與分化、維持第二性征及性功能等有關(guān)，輻射致睪丸間質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷可引起男性生理及性生活方面的問題，并顯著影響其生活質(zhì)量。2013年2月18日～2014年3月30日，我們觀察了中藥八珍湯、六味地黃丸、自擬扶正解毒方劑對(duì)60Coγ-射線致大鼠生殖系統(tǒng)損傷的防治作用。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要儀器及藥物 健康雄性Wister大鼠150只，體質(zhì)量180～200 g，購自北京華阜康生物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)為 SCKX(京)2009-0007。飼養(yǎng)于采光充足、室溫可控的動(dòng)物房，室溫22℃，自由攝取水及普通鼠全價(jià)顆粒飼料。日月神伽馬刀來自西安一體醫(yī)療科技有限公司。八珍湯出自《正體類要》，由當(dāng)歸10 g、川芎6 g、白芍10 g、熟地黃10 g、人參5 g、炒白術(shù)10 g、茯苓10 g、炙甘草10 g組成;六味地黃丸出自《小兒藥證直訣》，由熟地黃20 g、山茱萸 12 g、山藥10 g、澤瀉 10 g、茯苓 10 g、牡丹皮10 g組成;自擬扶正解毒方劑由人參10 g、冬蟲夏草3 g、麥冬20 g、白花蛇舌草15 g、丹參20 g組成。上述中藥由三九藥業(yè)顆粒劑配置而成，按人體給藥量換算成大鼠等效劑量作為大鼠給藥量，給藥劑量依次為9.94、10.08、9.52 g/(kg·d)。

1.2 動(dòng)物分組、給藥及60Coγ-射線照射方法 150只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、輻射組、輻射八珍湯組、輻射六味地黃丸組、輻射自擬扶正解毒方劑組，各30只;后三組每天上午8:00分別給予八珍湯、六味地黃丸、自擬扶正解毒方劑灌胃2.5 mL，前兩組給予等容積生理鹽水灌胃，連續(xù)10 d;第11天，輻射組、輻射八珍湯組、輻射六味地黃丸組、輻射自擬扶正解毒方劑組分別接受一次性7 Gy的60Coγ-射線照射(大鼠四肢展開，固定于自制木板，置于伽馬刀可照射區(qū)域內(nèi)，給予一次性7 Gy的60Coγ-射線照射，劑量率1.614 Gy/min，總時(shí)長(zhǎng)約4 min 38 s)，空白對(duì)照組不接受照射，之后繼續(xù)上述方法灌胃14 d。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般情況觀察 輻射后對(duì)各組大鼠的精神狀況、活躍程度、反應(yīng)、毛色、進(jìn)食量、體質(zhì)量等一般情況進(jìn)行觀察。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物睪丸指數(shù)的計(jì)算、精子相對(duì)計(jì)數(shù)、睪丸組織形態(tài)學(xué)觀察 各組大鼠分別于輻射后第1、14、30天取材:第1天，每組10只大鼠取材;第14天，每組取存活大鼠數(shù)量的1/2取材;第30天，余下大鼠全部取材。10%水合氯醛腹腔麻醉取材大鼠，腹主動(dòng)脈采血;放血處死后迅速將睪丸切除，取雙側(cè)睪丸，用冷生理鹽水沖洗，除去血液，濾紙濾干，電子天平稱重，計(jì)算平均睪丸質(zhì)量，并計(jì)算睪丸指數(shù)，睪丸指數(shù)=睪丸質(zhì)量/輻射后30 d小鼠體質(zhì)量。雙側(cè)睪丸稱重后沿縱軸切為兩半。隨機(jī)選擇一半睪丸組織投入液氮中固定，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?另一半睪丸組織用中性甲醛固定，4 μm厚切片，HE染色，光鏡下觀察睪丸組織結(jié)構(gòu)。

取輻射后第14天各組大鼠的左側(cè)附睪，放入盛有3 mL生理鹽水的平皿中，用眼科剪充分剪碎，并輕壓組織塊，使精子溢出，用單層擦鏡紙過濾，濾液4 000 r/min離心10 min，沉淀物加入1 mL精子固定液，充分混勻，固定2 h后，滴入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，計(jì)數(shù)4個(gè)方格內(nèi)精子數(shù)，并計(jì)為R，R×4 000×固定液體積/附睪質(zhì)量即為精子相對(duì)計(jì)數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。輻射前后各組體質(zhì)量比較用重復(fù)測(cè)量方差分析;各組睪丸指數(shù)、精子相對(duì)計(jì)數(shù)比較用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般情況 空白對(duì)照組大鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)階段毛色光滑、食欲正常。其余四組在輻射后出現(xiàn)精神萎靡、毛發(fā)枯槁并散亂豎起、反應(yīng)遲鈍、食欲下降等，輻射八珍湯組、輻射六味地黃丸組、輻射自擬扶正解毒方劑組程度較輕，其中輻射自擬扶正解毒方劑組程度最輕。輻射前后各組大鼠體質(zhì)量變化比較見表1。

表1 輻射前后各組大鼠體質(zhì)量變化比較(g，±s)

表1 輻射前后各組大鼠體質(zhì)量變化比較(g，±s)

注:與同時(shí)間點(diǎn)空白對(duì)照組相比，*P＜0.01;與同組輻射前1 d相比，△P＜0.01

組別30 d輻射組 267.17 ± 6.37 242.67 ± 6.39△體質(zhì)量輻射前1 d 輻射后1 d 輻射后14 d 輻射后273.67 ±19.77 341.00 ±21.42輻射八珍湯組 262.00 ±12.64 245.83 ±10.63△ 277.83 ±13.26 343.67 ±13.75輻射六味地黃丸組 260.17 ± 7.94 241.17 ± 4.49＊△ 260.67 ±15.85 324.50 ±30.30輻射自擬扶正解毒方劑組 258.50± 9.31 246.17± 5.14△ 262.67± 8.44 326.17±21.39空白對(duì)照組 257.17 ±10.65 270.17 ± 5.19 300.00 ± 6.57 374.50 ± 3.84

2.2 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物睪丸指數(shù)及精子相對(duì)計(jì)數(shù)比較各組動(dòng)物睪丸指數(shù)及精子相對(duì)計(jì)數(shù)比較見表2。

表2 各組動(dòng)物睪丸指數(shù)及精子相對(duì)計(jì)數(shù)比較(±s)

表2 各組動(dòng)物睪丸指數(shù)及精子相對(duì)計(jì)數(shù)比較(±s)

注:與輻射組相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 睪丸指數(shù)(mg/g) 精子相對(duì)計(jì)數(shù)(×105/g)8.289 ±0.324 4.398 ±0.496輻射八珍湯組 8.461 ±0.417 4.787 ±0.745輻射六味地黃丸組 8.453 ±0.410 4.932 ±1.062*輻射自擬扶正解毒方劑組 8.637±0.352＊＊ 6.048±0.983＊＊空白對(duì)照組輻射組8.856 ±0.456 5.912 ±0.705

2.3 各組動(dòng)物睪丸間質(zhì)細(xì)胞病理學(xué)變化 空白對(duì)照組睪丸間質(zhì)細(xì)胞多呈橢圓形，細(xì)胞大，胞質(zhì)豐富;細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，染色較淡(圖1左)。輻射組睪丸間質(zhì)細(xì)胞呈多邊形或梭形，較稀疏，散在分布，胞質(zhì)減少，細(xì)胞核皺縮，染色質(zhì)濃集，深染(圖1中)。輻射自擬扶正解毒方劑組睪丸間質(zhì)細(xì)胞損傷現(xiàn)象較輻射組有所恢復(fù)，形態(tài)接近正常(圖1右)。

圖1 空白對(duì)照組(左)、輻射組(中)、輻射自擬扶正解毒方劑組(右)大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)(×400)

3 討論

《內(nèi)經(jīng)》謂，正氣存內(nèi)，邪不可干。正氣能抵御外邪入侵，防止疾病的發(fā)生，并且有利于病后恢復(fù)或自愈，核輻射也是一種外來致病邪氣，可通過提高機(jī)體抗病能力，維持陰陽平衡自穩(wěn)定態(tài)而對(duì)抗邪氣對(duì)機(jī)體的損害［5］。祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，核輻射為一種熱毒、火毒之邪，易耗氣傷津，核輻射損傷，起病急驟，病勢(shì)危重，變化多端。由于輻射作用的特點(diǎn)，其毒邪兼具火熱邪氣的特點(diǎn)，熱毒蘊(yùn)于體內(nèi)，充斥三焦［6］。腎藏精主骨生髓，腎精匱乏，生髓乏源，可降低機(jī)體免疫能力;腎屬水，水克火，唐·王冰注解《素問·至真要大論》提出:“壯水之主，以制陽光”，在火熱之邪傷陰的情況下可滋補(bǔ)腎精，陰得陽生則泉源不竭而解火毒。從腎生理功能而言，腎主骨，藏精生髓，能防治核輻射對(duì)機(jī)體造血和免疫系統(tǒng)的損害;從五行特性而言，腎屬水，水克火，能減輕具有火熱之性的核輻射射線對(duì)機(jī)體的燒灼傷。由此可見，從腎論治的角度來研發(fā)抗核輻射損傷的中藥防護(hù)劑有豐富的中醫(yī)基礎(chǔ)理論支持［7］。

我們選擇具有代表性的補(bǔ)氣益血八珍湯、滋陰補(bǔ)腎六味地黃丸、自擬扶正解毒方劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，觀察上述中藥的核輻射防護(hù)作用，篩選防護(hù)作用最強(qiáng)的中藥方劑，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)中藥組成進(jìn)行調(diào)整。自擬扶正解毒方劑中，人參根的多糖提取物人參皂苷能夠刺激內(nèi)源性細(xì)胞因子如 IL-1、IL-6的產(chǎn)生［8～10］。冬蟲夏草具有補(bǔ)肺益腎、止血化痰之效，既取其“陽中求陰，陰得陽生而泉源不絕”之意，增加六味地黃丸滋陰清熱之力，又能抑制機(jī)體病理產(chǎn)物生成，且冬蟲夏草的多種有效成分，如蟲草多糖等［11］，對(duì)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)及巨噬細(xì)胞有明顯激活作用［12，13］，能促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，是一種非特異性免疫增強(qiáng)及調(diào)節(jié)劑，具有促進(jìn)造血功能、提高免疫力、抗癌、降血糖、降血脂等功效［14］。白花蛇舌草具有清熱解毒、消癰散結(jié)、利尿除濕之功［15］，善清火熱毒邪，減輕輻射的火熱之性，防止癰癤疔瘡生成，并通過“下法”促進(jìn)病理代謝產(chǎn)物的排出。本研究結(jié)果表明，自擬扶正解毒方劑對(duì)60Coγ-射線輻射對(duì)大鼠生殖系統(tǒng)造成的損傷有一定的防治作用。

［1］賀許良，盧先州，陳枚，等.免疫器官輻射損傷與防護(hù)的研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，14(5):997-1000.

［2］Mao JP，F(xiàn)ang J，Zhou Y，et al.Immunomodulator，immunosuppression of radiation and immune reconstruction［J］.Bull Acad Mil Med Sci，2010，34(5):480-484.

［3］Tajima G，Delisle AJ，Hoang K，et al.Immune system phenotyping of radiation and radiation combined injury in outbred mice［J］.Radiat Res，2013，179(1):101-112.

［4］張衛(wèi)星，楊杰，王瑞，等.60Co-γ射線致大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)及睪酮合成功能的損害［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33(17):1823-1826.

［5］楊云霜，張蓉，李延暉，等.中藥對(duì)免疫器官抗核輻射損傷的實(shí)驗(yàn)研究［J］.湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，15(2):21-23.

［6］張蓉，駱斌，李峰，等.從毒邪致病論電離輻射損傷的中醫(yī)病機(jī)［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，30(9):595-596.

［7］楊云霜，張蓉，江其生，等.從腎論治核輻射損傷中醫(yī)病因病機(jī)［J］.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，28(6):1021-1022.

［8］王慶賓，韓婷，孫連娜，等.抗輻射的天然藥物研究進(jìn)展［J］.藥學(xué)實(shí)踐雜志，2012，30(3):171-177.

［9］Song JY，Han SK，Bae KG，et al.Radio protective effects of ginsan，an immunomodulator［J］.Radiat Res，2003，159(6):768-774.

［10］Hazra B，Ghosh S，Kumar A，et al.The prospective role of plant products in radiotherapy of cancer:a current overview［J］.Front Pharmacol，2012，(2):94.

［11］Zhao J，Xie J，Wang LY，et al.Advanced development in chemical analysis of Cordyceps［J］.J Pharm Biomed Anal，2014，(87):271-289.

［12］Chen WX，Zhang WY，Shen WB，et al.Effects of the acid polysaccharide fraction isolated from a cultivated Cordyceps sinensis on macrophages in vitro［J］.Cell Immunol，2010，262(1):69-74.

［13］Lee JS，Kwon JS，Won DP，et al.Study of macrophage activation and structural characteristics of purified polysaccharide from the fruiting body of Cordyceps militaris［J］.J Microbiol Biotechnol，2010，20(7):1053-1060.

［14］楊穎，黃俊明，蔡玟，等.蛹蟲草對(duì)輻射致免疫低下小鼠保護(hù)作用［J］.中國(guó)公共衛(wèi)生，2011，27(5):610-611.

［15］陳秀珍，潘榮斌，朱大誠(chéng).白花蛇舌草對(duì)白細(xì)胞影響的研究進(jìn)展［J］.中藥材，2014，37(2):356-359.