李 誠(chéng)，林曉杰，陳燕燕，張麗娟，李 堂

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東青島266003)

1型糖尿病(T1DM)是因機(jī)體胰島素絕對(duì)缺乏導(dǎo)致血糖持續(xù)升高的一類糖尿病。機(jī)體免疫功能紊亂致胰島β細(xì)胞凋亡，是本病的重要發(fā)病機(jī)制之一，多種免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子參與了上述過(guò)程。其中，輔助性T細(xì)胞(Th)亞群的失衡受到越來(lái)越多的關(guān)注。Th細(xì)胞主要分為Th1、Th2兩大亞群。Th1 主要分泌 IL-1、IL-2、IL-12、IFN-γ 、TNF-α等，參與細(xì)胞免疫、介導(dǎo)炎性反應(yīng)及胰島β細(xì)胞的凋亡。Th2主要分泌 IL-4、IL-10、IL-5、IL-6、IL-9、IL-13等，參與體液免疫、誘導(dǎo)免疫耐受。Th1亞群比例升高、Th2亞群比例降低誘導(dǎo)并加重胰島 β 細(xì)胞凋亡，介導(dǎo) T1DM發(fā)生［1］。IL-10為Th2分泌的重要細(xì)胞因子，具有免疫抑制及抗凋亡作用［2～4］。我們?cè)谇捌谘芯恐谐晒?gòu)建了有IL-10基因的重組腺病毒(Ad-mIL-10)［5］，并已證實(shí)IL-10對(duì)體外培養(yǎng)的胰島β細(xì)胞具有保護(hù)作用，且 IL-10可預(yù)防 NOD鼠 T1DM 的發(fā)生［6］。而IL-10在藥物誘導(dǎo)發(fā)病的NOD鼠胰島β細(xì)胞的保護(hù)方面，未取得理想結(jié)果，但并不排除誘導(dǎo)藥物對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響［7］。2012年11月1日～2013年1月15日，我們利用 T1DM自然發(fā)病 NOD鼠，觀察了Ad-mIL-10對(duì)其早期殘存胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及材料 7～9周齡雌性 NOD/Lt小鼠(清潔級(jí))30只，體質(zhì)量19～21 g，生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2009-0004，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，25周齡時(shí)T1DM自然發(fā)病率達(dá)70%以上，將其置于青島大學(xué)附屬醫(yī)院動(dòng)物房(環(huán)境為SPF級(jí))飼養(yǎng)。全部小鼠自由飲食飲水，密切觀察小鼠是否存在多飲、多尿、多食、毛發(fā)無(wú)光澤或生命活力下降等表現(xiàn)，每周定時(shí)測(cè)定小鼠尿糖、體質(zhì)量、血糖;用代謝籠收集小鼠尿液，用半定量尿糖試紙粗略檢測(cè)小鼠尿糖，當(dāng)尿糖陽(yáng)性時(shí)，采集小鼠尾靜脈血，測(cè)血糖，當(dāng)連續(xù)2次小鼠尾靜脈血血糖≥13.9 mmol/L時(shí)，診斷為糖尿病。人胚腎293細(xì)胞由青島大學(xué)羅兵教授惠贈(zèng)。Ad-mIL-10由青島大學(xué)附屬醫(yī)院陳志紅教授惠贈(zèng)，病毒滴度為1.0×109pfu/mL?？焖贆z測(cè)腺病毒感染性滴度試劑盒購(gòu)自北京本元正陽(yáng)公司。鼠IL-4、IL-10、IFN-γ、C肽的ELISA試劑盒來(lái)自美國(guó)R＆D公司。DAB顯色試劑盒來(lái)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。血糖儀為美國(guó)強(qiáng)生穩(wěn)豪型。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 選取17～20周齡近期發(fā)病(診斷為T1DM不超過(guò)3 d)的雌性NOD小鼠12只，隨機(jī)分為A、B組(各6只);另選取相同周齡未發(fā)病的NOD鼠6只為C組。

1.2.2 動(dòng)物處理、觀察及標(biāo)本采集 A組發(fā)病后立即予腹腔注射0.1 mL的Ad-mIL-10，B、C組未予任何干預(yù)。實(shí)驗(yàn)前(T1DM發(fā)病時(shí))及實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后第1、2、3周記錄小鼠體質(zhì)量、尿糖及血糖。實(shí)驗(yàn)第3周時(shí)處死全部小鼠，采用摘眼球法取全血，制備血清，-20℃冰箱保存;取胰腺，甲醛固定，做病理切片，備做HE及免疫組化染色。

1.2.3 胰腺局部IL-10檢測(cè) 采用SABC法觀察胰腺局部IL-10的表達(dá)情況。在400×高倍鏡視野下，每張胰腺切片連續(xù)觀察5個(gè)胰島，胞質(zhì)內(nèi)含有棕黃色顆粒的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞。依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比及胞質(zhì)內(nèi)顆粒著色強(qiáng)度不同，給予不同評(píng)分:陽(yáng)性細(xì)胞＜1%計(jì)0分、1%～10%計(jì)1分、11%～50%計(jì)2分、51%～80%計(jì)3分、＞80%計(jì)4分;細(xì)胞無(wú)著色計(jì)0分、淡黃色計(jì)1分、黃色計(jì)2分、棕黃色計(jì)3分。

1.2.4 胰島炎程度評(píng)定 胰腺切片HE染色。由專業(yè)病理人員觀察并進(jìn)行雙盲法判定。胰島炎浸潤(rùn)程度分級(jí):0級(jí)為胰島完整，沒(méi)有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn);1級(jí)為淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)胰島周圍或＜25%的胰島面積受累;2級(jí)為淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)25%～50%的胰島;3級(jí)為淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)＞50%的胰島［8］。在400×高倍鏡視野下連續(xù)觀察5個(gè)胰島組織的炎癥程度，統(tǒng)計(jì)各級(jí)胰島組織個(gè)數(shù)。

1.2.5 血清 IL-10、IL-4、IFN-γ 檢測(cè) 用 ELISA 法檢測(cè)上述-20℃冰箱保存的血清中的IL-10、IL-4、IFN-γ的 OD值，計(jì)算出相應(yīng)的濃度值，并計(jì)算IFN-γ/IL-4，以評(píng)估Th細(xì)胞亞群狀態(tài)。

1.2.6 血清C肽檢測(cè) 采用 ELISA法檢測(cè)上述-20℃冰箱保存的血清中的C肽OD值，并計(jì)算出相應(yīng)濃度值。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)及方差齊性分析，若不符合正態(tài)分布及方差不齊，將數(shù)據(jù)進(jìn)行Log/Ln/Sin/Sqrt轉(zhuǎn)換;對(duì)于正態(tài)分布計(jì)量資料，多組間的兩兩比較用單因素方差分析和LSD檢驗(yàn);對(duì)進(jìn)行Log/Ln/Sin/Sqrt等轉(zhuǎn)換后仍不符合正態(tài)分布及方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行Games-Howell檢驗(yàn)及Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn);對(duì)等級(jí)資料行Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組NOD鼠血糖及體質(zhì)量比較 各組NOD鼠血糖及體質(zhì)量比較見(jiàn)表1、2。

表1 各組NOD鼠血糖比較(mmol/L，±s)

表1 各組NOD鼠血糖比較(mmol/L，±s)

注:與 C 組相比，ΔP ＜0.05

組別血糖實(shí)驗(yàn)前 實(shí)驗(yàn)第1周 實(shí)驗(yàn)第2周 實(shí)驗(yàn)第3周A組 20.40±3.92Δ 21.02±8.98Δ 24.12±9.01Δ 26.97± 9.64Δ B 組 18.13 ±5.35Δ 19.72 ±8.65Δ 24.82 ±8.96Δ 26.35 ±11.09Δ C組5.17 ±1.56 6.18 ±0.32 6.25 ±0.87 6.30 ± 1.38

表2 各組NOD鼠體質(zhì)量比較(g，±s)

表2 各組NOD鼠體質(zhì)量比較(g，±s)

注:與 C 組相比，ΔP ＜0.05

組別體質(zhì)量實(shí)驗(yàn)前 實(shí)驗(yàn)第1周 實(shí)驗(yàn)第2周 實(shí)驗(yàn)第3周A 組 24.24 ±2.79 24.53 ±2.64 24.15 ±3.61 22.86 ±1.87Δ B 組 23.15 ±1.73 23.99 ±2.07 24.71 ±1.65 24.32 ±2.14 C 組 23.90 ±2.27 24.87 ±2.99 25.54 ±3.27 26.05 ±3.10

2.2 各組NOD鼠IL-10在胰腺局部的表達(dá)比較A組染色最深，著色顆粒在胰島內(nèi)分布最廣;B組和C組染色較淺，著色顆粒在胰島內(nèi)分布稀疏。SABC法染色陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)分和染色強(qiáng)度計(jì)分的乘積A組為5.62 ±0.81、B 組為 1.50 ±0.54、C 組為 4.67 ±1.03。A、C組與 B 組相比，P 均 ＜0.01;A、C 組相比，P ＞0.01。

2.3 各組NOD鼠胰島炎程度比較 各組NOD鼠各等級(jí)胰腺炎的胰島數(shù)量見(jiàn)表3;A、B組與C組相比，P 均 ＜0.01;A、B 組相比，P ＜0.05。

表3 各組NOD鼠各等級(jí)胰腺炎的胰島數(shù)量(個(gè))

2.4 各組 NOD 鼠血清 IL-10、IL-4、IFN-γ、C 肽水平及IFN-γ/IL-4比較 檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4、5。

表4 各組NOD鼠血清IL-4、IFN-γ水平及 IFN-γ/IL-4 比較(±s)

表4 各組NOD鼠血清IL-4、IFN-γ水平及 IFN-γ/IL-4 比較(±s)

注:與 C 組相比，ΔP ＜0.01;與B 組相比，#P ＜0.01

組別 IFN-γ(pg/mL) IL-4(pg/mL) IFN-γ/IL-4 A 組 295.62 ±20.29Δ# 45.06 ±1.48Δ# 6.56 ±0.46Δ#B 組 476.72 ±27.12Δ 34.58 ±2.40Δ 13.84 ±1.21Δ C組234.42 ±28.44 78.72 ±5.89 2.99 ±0.43

表5 各組NOD鼠血清IL-10、C肽水平比較(±s)

表5 各組NOD鼠血清IL-10、C肽水平比較(±s)

注:與 C 組相比，ΔP ＜0.01;與B 組相比，#P ＜0.01

組別 IL-10(pg/mL) C肽(ng/mL)A 組 183.02 ±11.40Δ# 4.491 ±0.338Δ#B組 124.95± 9.49Δ 3.296±0.328Δ C組255.96 ±31.10 7.050 ±0.500

3 討論

T1DM是一種器官特異性自身免疫病。機(jī)體免疫功能紊亂包括自身抗體的產(chǎn)生、免疫細(xì)胞的活化、炎性因子的釋放等。目前，針對(duì)T1DM的免疫治療主要集中在抗原特異性免疫治療、免疫抑制劑、免疫因子等方面，但上述方法大多未能通過(guò)Ⅱ、Ⅲ期臨床試驗(yàn)。其原因可能有以下幾方面:胰島自身抗原種類繁多，免疫紊亂機(jī)制復(fù)雜;人體耐受劑量低于藥物的有效治療劑量，藥物不良反應(yīng)多;干預(yù)時(shí)機(jī)難于把握，一些患者起病時(shí)胰島β細(xì)胞已損傷殆盡，臨床很難做到早期干預(yù);動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中T1DM模型不能完全模擬人自然發(fā)病過(guò)程等因素也限制了免疫治療在T1DM臨床中的應(yīng)用。

IL-10主要由Th2細(xì)胞分泌，具有以下作用:①IL-10可以下調(diào)單核-巨噬細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞表面主要組織相容性復(fù)合體(MHC)-Ⅱ類分子及協(xié)同刺激分子的表達(dá)，降低其抗原提呈作用［2］。②IL-10可促進(jìn)巨噬細(xì)胞表面清道夫受體的表達(dá)，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬活性。③IL-10可抑制已經(jīng)活化的抗原提呈細(xì)胞分泌炎性因子(IL-1、IL-12、TNF等)及趨化因子［9，10］。④IL-10可以抑制前列腺素 E2的表達(dá)，抑制樹(shù)突細(xì)胞的分化和成熟［11］。⑤IL-10可通過(guò)抑制抗原提呈細(xì)胞的作用，間接抑制 T細(xì)胞功能［12，13］。同時(shí)，IL-10可直接啟動(dòng)T細(xì)胞內(nèi)抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。⑥IL-10可通過(guò)抑制Fas表達(dá)，發(fā)揮抗凋亡作用［3，4］?；?IL-10 的上述作用，應(yīng)用外源性 IL-10抑制T1DM患者胰腺過(guò)度的炎性反應(yīng)，保護(hù)機(jī)體殘存胰島β細(xì)胞功能，成為可能。本研究結(jié)果顯示，A組胰腺局部IL-10表達(dá)及血清IL-10水平明顯高于B組，提示給予外源性IL-10，其可在胰腺局部高表達(dá)，且能在NOD鼠體內(nèi)產(chǎn)生IL-10。

機(jī)體免疫系統(tǒng)是個(gè)復(fù)雜的龐大網(wǎng)絡(luò)，免疫細(xì)胞及免疫分子間相互協(xié)調(diào)，相互制衡。Th1/Th2淋巴細(xì)胞亞群失衡是導(dǎo)致 T1DM發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［1］。Th1細(xì)胞分泌多種炎性因子，其中 IL-1、IFN-γ及TNF-α在胰島β細(xì)胞的殺傷過(guò)程中起重要作用。Th2細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞因子，其中IL-4可阻止炎性細(xì)胞的趨化過(guò)程，促進(jìn)Th2細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞免疫反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，與C組相比，B組血清IFN-γ水平升高，IL-4降低，IFN-γ/IL-4升高，提示T1DM自然發(fā)病的NOD鼠出現(xiàn)了明顯的Th1/Th2淋巴細(xì)胞亞群失衡現(xiàn)象。發(fā)病后，立即予Ad-mIL-10干預(yù)，A組血清 IFN-γ水平明顯降低，IL-4明顯升高，IFN-γ/IL-4降低，但未達(dá) C組水平。提示Ad-mIL-10干預(yù)，可增強(qiáng)T1DM早期發(fā)病NOD鼠Th2細(xì)胞功能，抑制Th1細(xì)胞功能，部分逆轉(zhuǎn)Th1/Th2細(xì)胞失衡狀態(tài)。

C肽是胰島素原生成胰島素時(shí)的副產(chǎn)物，可反應(yīng)胰島β細(xì)胞功能，是評(píng)估殘存胰島β細(xì)胞功能的重要指標(biāo)，對(duì)延緩T1DM并發(fā)癥的出現(xiàn)具有重要作用［14］。因此，早期維持患者C肽高水平，十分必要。本研究結(jié)果顯示，C組C肽水平最高，B組最低，予Ad-mIL-10干預(yù)后，A組C肽水平升高。提示IL-10干預(yù)部分改善了胰島β細(xì)胞功能，對(duì)間接促進(jìn)胰島素分泌有一定作用。

與人類T1DM發(fā)病機(jī)制相似，自然發(fā)病的NOD鼠胰腺內(nèi)出現(xiàn)明顯的樹(shù)突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、B細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。本研究結(jié)果顯示，IL-10基因干預(yù)無(wú)減輕胰島炎作用，在控制T1DM發(fā)病NOD鼠血糖及體質(zhì)量方面也無(wú)明顯作用。原因有以下幾方面:T1DM的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，單一免疫抑制劑不能達(dá)到理想效果;IL-10在該劑量作用下，不能減輕胰島炎，不能有效控制血糖。

總之，IL-10基因干預(yù)，對(duì)T1DM自然發(fā)病NOD鼠，可使其體內(nèi) IFN-γ水平降低，IL-4水平升高，IFN-γ/IL-4降低，發(fā)揮一定的免疫調(diào)節(jié)作用;IL-10基因干預(yù)，可增加T1DM自然發(fā)病NOD鼠血清C肽水平，一定程度上改善胰島β細(xì)胞功能。該劑量單一IL-10基因干預(yù)，無(wú)減輕胰島炎及控制血糖作用。

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