孟傳萍，劉 東，張淑華，趙姣姣

(1寧津縣人民醫(yī)院，山東德州253400;2青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

黃芪作為一種傳統(tǒng)中藥，生用可益衛(wèi)固表、破血逐瘀、托毒生肌，灸用可補中益氣［1］。近年研究發(fā)現(xiàn)，黃芪對缺血再灌注損傷有保護作用，其可通過減少自由基生成、增加腦血流量，進一步減輕細胞損傷［2，3］。缺血缺氧導(dǎo)致的神經(jīng)細胞凋亡是腦梗死和腦出血等疾病重要的病理基礎(chǔ)［4］。2013年6月～2013年12月，我們觀察了黃芪對大鼠神經(jīng)細胞缺氧性凋亡的影響，現(xiàn)分析結(jié)果，并探討其可能的作用機制，旨在為黃芪注射液在腦缺氧缺血性疾病治療中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 大鼠神經(jīng)細胞分離與培養(yǎng) 出生20 h內(nèi)雌性SD大鼠24只，體質(zhì)量2～8 g。脫臼法處死大鼠，眼科剪剪取大鼠大腦，取出大腦皮質(zhì)，分成1 mm3的小塊，室溫下消化20 min，用10%FBS終止其反應(yīng)，用培養(yǎng)基清洗2次，滴加完全培養(yǎng)基吹打，靜置10 min，吸取上清細胞懸液過70 μm尼龍網(wǎng)篩，血計數(shù)板計數(shù)細胞，以3×105/mL密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔分別加入0.1 mL，培養(yǎng)板置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，后吸取培養(yǎng)基，繼續(xù)加入2%B27Neurobasal培養(yǎng)液培養(yǎng)，3 d后半量換液。

1.2 缺氧性凋亡細胞模型制備與分組處理 將細胞分為對照組、模型組、黃芪組，對照組及模型組每組4個復(fù)孔，黃芪組12個復(fù)孔。對照組常規(guī)飼養(yǎng)，模型組、黃芪組參照文獻［4］制作缺氧性凋亡細胞模型:將神經(jīng)細胞置于缺氧罐中，通入95%N2和5%CO2的混合氣體，流量為 2.0 L/min，持續(xù)20 min，封閉的缺氧罐置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h后將細胞從缺氧罐中取出，放入培養(yǎng)箱中復(fù)氧后繼續(xù)培養(yǎng)。制模后黃芪組分別加入1、10、100 μg/mL的黃芪注射液(每濃度4個復(fù)孔);模型組及對照組不加入藥物。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.3.1 細胞形態(tài)學(xué)變化 處理后6 h吸去板內(nèi)培養(yǎng)基，將100 μg/mL 丫碇橙(AO)和 100 μg/mL 嗅乙啶(EB)等量混勻，每孔分別加入10 μL后靜置10 min，熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學(xué)變化。

1.3.2 細胞超微結(jié)構(gòu)改變 處理后6 h收取細胞，離心機富集后棄上清，4℃預(yù)冷，戊二醛固定，2 h后PBS洗滌，鋨酸固定，梯度乙醇丙酮脫水，常規(guī)包埋、聚合、超薄切片、鉛染，透射電鏡下觀察凋亡細胞超微結(jié)構(gòu)變化。

1.3.3 細胞凋亡情況 處理后12、24 h取各組細胞冷PBS液清洗2次，加入70%的乙醇4℃固定過夜。離心機離心，棄去上清，加入 TritonX-100及RNaseA 各200 μL，15 min 后加入 PI染料 1 mL，室溫下避光靜置15 min，于流式細胞儀進行熒光檢測(激發(fā)波長490 nm，發(fā)射波長670 nm)，計算細胞凋亡率。

1.3.4 Bcl-2、Caspase-8蛋白表達 采用 Western blot法檢測。各組處理后6 h取各組細胞，RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，PBS調(diào)整蛋白終濃度為1 μg/μL，用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，脫脂奶粉封閉，2 h后放入兔抗人Bcl-2、Caspase-8單克隆抗體，4℃孵育過夜，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗(羊抗兔)室溫孵育2 h，滴加ECL液顯色，最后進行曝光拍照。各組蛋白表達與內(nèi)參GAPDH相比，計算相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料用±s表示，重復(fù)測量數(shù)據(jù)比較采用多因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)與超微結(jié)構(gòu) 熒光顯微鏡下，AO染色的細胞核呈黃綠色光，可濃聚成顆粒狀，多位于細胞一側(cè)，EB染色的晚期凋亡細胞核呈桔紅色，濃聚或偏向，還可見少數(shù)細胞核碎裂成塊狀。10 μg/mL黃芪處理的細胞少量顆粒聚集在細胞一側(cè)，核呈淡黃綠色;100 μg/mL黃芪處理的細胞凋亡數(shù)明顯減少，核呈淡黃色，幾乎看不到核碎裂象。電鏡下，模型組大鼠皮層神經(jīng)細胞可見細胞邊緣起泡出芽、膨出，部分凋亡細胞內(nèi)觀察到凋亡小體;黃芪組中100 μg/mL黃芪處理的細胞呈卵圓型，邊緣有少量微絨毛，胞質(zhì)內(nèi)線粒體可觀察到線粒體峭，核糖體存在于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面，細胞核內(nèi)可見核仁，細胞染色質(zhì)正常。

2.2 神經(jīng)細胞凋亡情況 各組神經(jīng)細胞凋亡率見表1。黃芪組、模型組細胞凋亡率高于對照組(P均＜0.05)，但黃芪組神經(jīng)細胞凋亡率低于模型組，且凋亡率隨黃芪濃度的增加而減少(P均＜0.05)。

表1 各組神經(jīng)細胞凋亡率比較(n=4，%，±s)

表1 各組神經(jīng)細胞凋亡率比較(n=4，%，±s)

注:與對照組相比，*P ＜0.05;與模型組相比，#P ＜0.05;與黃芪組1 μg/mL 相比，△P ＜0.05;與黃芪組10 μg/mL 相比，☆P ＜0.05

組別 細胞凋亡率12 h 24 h 5.18 ±0.29 7.81 ±0.40黃芪組1 μg/mL 18.95 ±0.39*# 28.23 ±1.46*#10 μg/mL 14.20 ±0.62*#△ 19.12 ±0.58*#△100 μg/mL 11.41 ±0.95*#△☆ 13.86 ±0.37*#△模型組 21.57 ±1.21* 32.43 ±1.98*對照組

2.3 細胞Bcl-2、Caspase-8表達 黃芪組、模型組Bcl-2表達均低于對照組，但黃芪組高于模型組，且Bcl-2表達隨黃芪濃度的增加而增加(P均＜0.05)。黃芪組、模型組Caspase-8表達高于對照組，但黃芪組低于模型組，且Caspase-8表達隨黃芪濃度增加而降低(P均＜0.05)。見表2。

表2 各組細胞Bcl-2、Caspase-8表達比較(n=4，±s)

表2 各組細胞Bcl-2、Caspase-8表達比較(n=4，±s)

注:與對照組相比，*P ＜0.05;與模型組相比，#P ＜0.05;與黃芪組1 μg/mL 相比，△P ＜0.05;與黃芪組10 μg/mL 相比，☆P ＜0.05

組別Bcl-2 Caspase-8 1.35 ±0.37 0.29 ±0.10黃芪組1 μg/mL 0.37 ±0.15*# 0.87 ±0.25*#10 μg/mL 0.85 ±0.28*#△ 0.72 ±0.29*#△100 μg/mL 1.21 ±0.22*#△☆ 0.31 ±0.06*#△☆模型組 0.24 ±0.05* 0.98 ±0.35*對照組

3 討論

腦缺血缺氧性疾病臨床常見，神經(jīng)細胞缺氧性凋亡是其重要病理學(xué)改變［5］，逆轉(zhuǎn)凋亡為該類疾病重要的治療原則［6］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芪可使減少的血細胞恢復(fù)正常，擴張冠狀動脈，改善心臟功能，加強抗缺氧能力，防止脂質(zhì)過氧化，改善腎臟功能，防止肝糖原減少，還有抗衰老的功能［7］。近年來研究表明，黃芪有抗缺血再灌注損傷的作用，可改善缺血缺氧后腦血流量、減少自由基的生成、降低興奮性氨基酸毒性，從而減輕細胞損傷［8，9］。

本研究采用對缺血缺氧十分敏感的大鼠皮層神經(jīng)細胞進行原代培養(yǎng)，構(gòu)建缺氧性凋亡模型。結(jié)果顯示模型組細胞活性均明顯下降，可見大量凋亡細胞。各黃芪干預(yù)組細胞凋亡率均低于模型組，且細胞凋亡率隨黃芪濃度增加而降低，100 μg/mL的黃芪作用最明顯。這表明黃芪注射液可抑制缺氧神經(jīng)細胞凋亡，對缺氧后神經(jīng)系統(tǒng)康復(fù)有一定幫助。

研究發(fā)現(xiàn)細胞凋亡與多種基因調(diào)控有關(guān)，其中Bcl-2蛋白家族在細胞凋亡中發(fā)揮重要作用［10，11］。Bcl-2蛋白可通過調(diào)控Ca2+濃度，保持其動態(tài)平衡［12］。細胞凋亡依賴于對天冬氨酸特異的Caspase，進而產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)，而Caspase-8是死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑中關(guān)鍵的啟動因子［13，14］。其通過寡聚而自身切割活化，進一步激活下游半胱氨酸蛋白酶，產(chǎn)生凋亡效應(yīng)［15，16］。本研究發(fā)現(xiàn)黃芪能使缺氧神經(jīng)細胞中Bcl-2表達增加，Caspase-8表達降低，且高濃度黃芪組作用更為明顯，提示黃芪的抗神經(jīng)細胞凋亡作用可能與調(diào)控Bcl-2、Caspase-8表達有關(guān)。本研究結(jié)果可為臨床上使用黃芪提取物治療等缺氧性腦病提供理論依據(jù)。

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