胡道榮，李 杰

（重慶市合川區(qū)人民醫(yī)院，重慶 401520）

慢性腎臟?。–KD）是各種原因引起的慢性腎臟結(jié)構(gòu)和功能障礙。引起CKD的疾病主要包括各種原發(fā)性、繼發(fā)性腎小球腎炎、腎小管損傷和腎血管病變等。CKD往往伴有不同程度的脂質(zhì)代謝紊亂，后者既是許多原發(fā)性或繼發(fā)性腎臟疾病的常見臨床表現(xiàn)，同時也參與了腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展［1］。棕櫚酸是一種飽和高級游離脂肪酸，有研究表明一定濃度棕櫚酸對腎小管上皮細胞有損傷作用［2，3］。莪術(shù)油是我國傳統(tǒng)中藥，有活血化瘀之功效，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于腎炎、脂肪肝等的治療中［4～7］。2013年3月～2014年5月，我們采用棕櫚酸誘導(dǎo)構(gòu)建了人腎小管上皮細胞系HK-2脂毒性損傷模型，觀察了莪術(shù)油對腎小管上皮細胞的保護作用，現(xiàn)分析結(jié)果，探討其相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 材料 HK-2細胞（中科院上海細胞所），1640培養(yǎng)基和胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司），棕櫚酸（美國Sigma公司），莪術(shù)油注射液（浙江天瑞藥業(yè)有限公司），Trizol試劑（美國 Invitrogen公司），RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（寶生物工程大連有限公司），p53上調(diào)凋亡調(diào)控因子（PUMA）、細胞死亡調(diào)節(jié)因子（Bim）單抗（美國Sigma公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與處理 HK-2細胞用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)瓶放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，細胞生長至鋪滿瓶底80%左右時消化、傳代。HK-2細胞接種于96孔板，將細胞分為對照組、棕櫚酸組和莪術(shù)油組。對照組不作處理，棕櫚酸組分別加入終濃度為0.2、0.8 mmol/L的棕櫚酸，莪術(shù)油組分別加入終濃度為0.2、0.8 mmol/L的棕櫚酸與20 mg/L的莪術(shù)油。每濃度設(shè)5個復(fù)孔，各組處理 24 h。根據(jù)文獻［2，3］，0.2 mmol/L 棕櫚酸作用的細胞用于脂質(zhì)沉積情況觀察，0.8 mmol/L棕櫚酸作用的細胞用于細胞增殖檢測、相關(guān)基因及蛋白測定。

1.2.2 脂質(zhì)沉積情況觀察 各組培養(yǎng)18 h后吸棄培養(yǎng)基，將細胞接種于爬片，中性甲醛后油紅O染色，顯微鏡下（200×）觀察及采集圖像。

1.2.3 細胞增殖檢測 各組培養(yǎng)24 h后，每孔加入濃度為5 mg/mL的MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄培養(yǎng)基后每孔加入150 μL的二甲基亞砜。震蕩后酶標儀測490 nm波長處的OD值，各組OD值表示細胞相對增殖量。

1.2.4 TNF-α、p53基因測定 各組培養(yǎng)24 h后，用Trizol試劑提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)成cDNA。用Real-time PCR法檢測TNF-α和p53的相對表 達量。TNF-α 上游序列為 5＇-GCAGGTCTACTTTGGGATCATTG-3＇，下游序列為 5＇-GCGTTTGGGAAGGTTGGA-3＇;上游序列為 5＇-TTGGATCCATGTTTTGCCAACTGGCC-3＇，下游序列為 5＇-TTGAATTCAGGCTCCCCT TTCTTGCG-3＇。

1.2.5 PUMA、Bim蛋白表達測定 各組培養(yǎng)24 h后，分別加入適量細胞裂解液于冰上裂解細胞提取總蛋白。碧云天BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。采用Western blot法檢測 PUMA、Bim蛋白，按試劑盒說明書操作，采用Quantity One軟件對條帶灰度進行分析，實驗重復(fù)3次，取均值。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件。各組數(shù)據(jù)用±s表示，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 脂質(zhì)沉積情況 對照組細胞無明顯脂質(zhì)沉積;棕櫚酸組與莪術(shù)油組細胞內(nèi)均有明顯脂質(zhì)沉積，但兩組差異不大。見圖1。

圖1 各組細胞脂質(zhì)沉積情況

2.2 細胞增殖情況 對照組、棕櫚酸組與莪術(shù)油組OD 值分別為 1.02 ± 0.05、0.62 ± 0.04、0.79 ±0.03，其中對照組高于其他兩組，莪術(shù)油組高于棕櫚酸組（P均 ＜0.05）。

2.3 TNF-α、p53 mRNA 表達 對照組細胞 TNF-α、p53 mRNA相對表達量低于棕櫚酸組與莪術(shù)油組，莪術(shù)油組低于棕櫚酸組（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組TNF-α、p53 mRNA相對表達量比較（n=5，±s）

表1 各組TNF-α、p53 mRNA相對表達量比較（n=5，±s）

注:與對照組相比，*P ＜0.05;與棕櫚酸組相比，#P ＜0.05

組別 TNF-αmRNA p53 mRNA棕櫚酸組 1.64 ±0.07* 1.47 ±0.10*莪術(shù)油組 1.50 ±0.06# 1.30 ±0.05#對照組1.00 ±0.00 1.00 ±0.00

2.4 PUMA、Bim蛋白表達 與對照組相比，棕櫚酸組的PUMA表達水平明顯升高。與棕櫚酸組相比，莪術(shù)油組PUMA表達明顯降低（P＜0.05）。各組Bim蛋白表達無明顯差異。

表2 各組PUMA、Bim相對表達量比較（n=5，±s）

表2 各組PUMA、Bim相對表達量比較（n=5，±s）

注:與對照組相比，*P ＜0.05;與棕櫚酸組相比，#P ＜0.05

組別PUMA Bim棕櫚酸組 1.61 ±0.12*1.12 ±0.16莪術(shù)油組 1.34 ±0.08# 1.04 ±0.09對照組1.00 ±0.00 1.00 ±0.00

3 討論

近來研究認為，脂質(zhì)代謝紊亂是CKD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，代謝綜合征狀態(tài)可引起機體腎臟內(nèi)脂質(zhì)沉積和腎損傷［1］?！爸|(zhì)腎毒性學說”認為，體內(nèi)長期保持高游離脂肪酸水平，可誘導(dǎo)腎小管上皮細胞凋亡及促使腎臟疾病的發(fā)生，同時腎臟損害又可導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂，過量游離脂肪酸在腎臟內(nèi)積聚，導(dǎo)致發(fā)?。?～10］。此外游離脂肪酸本身的細胞毒性可損傷腎小管上皮細胞質(zhì)、線粒體及溶酶體膜，引起腎小管上皮細胞變性、壞死和炎癥細胞浸潤。棕櫚酸又稱軟脂酸，是一種飽和高級游離脂肪酸，以甘油酯的形式普遍存在于動植物油脂中，在自然界中分布很廣［11］。莪術(shù)油是從莪術(shù)中提取出來的揮發(fā)油，其主要成分為多種倍半萜類，包括莪術(shù)醇、莪術(shù)二醇、吉馬酮等，具有抗腫瘤、抗炎等功效，臨床應(yīng)用廣泛［12，13］。

本研究體外培養(yǎng)了HK-2細胞，分別經(jīng)棕櫚酸與莪術(shù)油處理，發(fā)現(xiàn)0.2 mmol/L的棕櫚酸可導(dǎo)致HK-2細胞脂質(zhì)沉積，0.8 mmol/L的棕櫚酸可導(dǎo)致HK-2細胞生長受抑，這與機體游離脂肪酸水平增高引發(fā)腎小管上皮細胞損害的病理過程相符。本研究發(fā)現(xiàn)，莪術(shù)油組與棕櫚酸組油紅染色結(jié)果差異不大，表明莪術(shù)油預(yù)保護對于棕櫚酸誘導(dǎo)的細胞脂質(zhì)沉積沒有明顯的抑制作用;但莪術(shù)油組細胞增殖情況好于棕櫚酸組，提示莪術(shù)油對于棕櫚酸誘導(dǎo)的細胞生長抑制有一定的保護作用。

為進一步明確莪術(shù)油的保護機制，我們觀察了三組TNF-α、p53 mRNA及PUMA、Bim蛋白的表達變化。TNF-α誘導(dǎo)腎小管上皮細胞凋亡效應(yīng)的產(chǎn)生很大程度上來自于其對損傷基因iNOS表達的誘導(dǎo)［14，15］。iNOS 是介導(dǎo)免疫性腎損傷、腎小管上皮細胞凋亡的關(guān)鍵基因，其表達增高可引起多種細胞發(fā)生凋亡和壞死。BH3-only蛋白是bcl-2家族中具有凋亡啟動作用的亞家族，包括PUMA和與bcl-2相互作用的Bim等，PUMA與Bim通過與bc-2/bax相互作用啟動內(nèi)源性凋亡途徑，導(dǎo)致細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)對照組細胞TNF-α、p53 mRNA、PUMA蛋白相對表達量低于棕櫚酸組與莪術(shù)油組，莪術(shù)油組低于棕櫚酸組，表明莪術(shù)油對腎小管上皮細胞的保護作用可能與調(diào)節(jié)BH3結(jié)構(gòu)或下游通路有關(guān)。PUMA表達主要受p53調(diào)節(jié)，而Bim主要結(jié)合在微管動力蛋白上發(fā)揮促凋亡活性［11，12］

綜上所述，莪術(shù)油對棕櫚酸誘導(dǎo)的HK-2細胞的脂毒性損傷有一定保護作用，可改善細胞增殖抑制狀態(tài)，其機制可能與抑制 TNF-α、p53 mRNA及PUMA蛋白表達有關(guān)。

［1］萬克強，廖俊蕾，趙蕾，等.炎癥對脂肪酸負荷的腎細胞FAT/CD36表達的影響［J］.中國病理生理雜志，2012，28（2）:308-313.

［2］Joshi-Barve S，Barve SS，Amancherla K，et al.Palmitic acid induces production of proinflammatory cytokine interleukin-8 from hepatocytes［J］.Hepatology，2007，46（3）:823-830.

［3］Akazawa Y，Cazanave S，Mott JL，et al.Palmitoleate attenuates palmitate-induced Bim and PUMA up-regulation and hepatocyte lipoapoptosis［J］.J Hepatol，2010，52（4）:586-593.

［4］張靜，彭六保，劉俏，等.中藥某些活性成分治療慢性腎衰的藥理研究概況［J］.中南藥學，2011，9（9）:696-699.

［5］劉紅艷，彭安邦，廖愛軍，等.莪術(shù)油注射液對肝星狀細胞凋亡的影響［J］.中華肝病雜志，2009，17（10）:790-791.

［6］吳海霞，孫志明，王勤.莪術(shù)油的藥理學研究及臨床應(yīng)用研究進展概況［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)刊，2011，13（1）:79-83.

［7］唐淵，李曉輝.莪術(shù)提取物對肝癌細胞系HepG2的抗癌作用及機制研究［J］.中國藥理學通報，2007，23（6）:790-794.

［8］Lupi R，Dotta F，Marselli L，et al.Prolonged exposure to free fatty acids has cytostatic and pro-apoptotic effects on human pancreatic islets:evidence that beta-cell death is caspase mediated，partially dependent on ceramide pathway，and Bcl-2 regulated［J］.Diabetes，2002，51（5）:1437-1442.

［9］左洋洋，付蕾，王文健，等.清道夫受體:脂質(zhì)腎損傷的關(guān)鍵［J］.中華腎臟病雜志，2014.30（2）:155-158.

［10］Akazawa Y，Cazanave S，Mott JL，et al.Palmitoleate attenuates palmitate-induced Bim and PUMA up-regulation and hepatocyte lipoapoptosis［J］.J Hepatol，2010，52（4）:586-593.

［11］劉芳，劉凱，劉道潔，等.棕櫚酸對肝癌HepG2細胞自噬和凋亡的影響［J］.山東醫(yī)藥，2014，54（12）:8-10.

［12］梁莉萍，賈存東.莪術(shù)油對乳腺癌癌前病變大鼠的治療效果及作用機制［J］.中國老年學雜志.2013，33（12）:2821-2823.

［13］劉阿紅.復(fù)方莪術(shù)油栓治療陰道炎160例臨床觀察［J］.中國實用醫(yī)藥，2013，8（20）:187-188.

［14］劉亮明，孫水林，葉長根，等.Pim-3基因抑制暴發(fā)性腎小管上皮細胞凋亡的機制［J］.中華肝臟病雜志，2012，20（9）:688-692.

［15］袁航屠，世良何，徐軍.PUMA和BIM表達與結(jié)直腸癌浸潤轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系［J］.中華外科學雜志，2013，51（6）:547-551.