劉春曉 李 輝 侯生才 胡 濱 苗勁柏 張文謙

(首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院胸外科，北京100020)

肺癌已成為當今世界上嚴重威脅人類健康與生命的惡性腫瘤之一。肺癌的臨床治療包括外科手術、化學治療、放射治療及分子靶向治療等多學科綜合治療。對肺癌發(fā)生、發(fā)展分子機制的研究能為肺癌的治療提供新的靶點。TRIM29定位于llq23，是TRIM家族的一員，含鋅指基因序列，可能是一種轉錄調控因子。有研究者［1］發(fā)現TRIM29在非小細胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)組織中表達有差異，但對其具體作用的研究仍較少。本研究發(fā)現，采用RNA干擾技術，抑制TRIM29的表達，可抑制肺癌細胞株NCI-H520的增生和遷移能力。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑

人肺癌細胞株(NCI-H520)購自中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院細胞庫，細胞培養(yǎng)液及血清均為美國Hyclone公司產品?？俁NA提取Trizol試劑盒，脂質體Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司。RT-PCR試劑盒購自天根生化科技有限公司。TRIM29引物和內參β-actin引物以及siRNA片段由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。TRIM29抗體購自Cell Signaling Technology公司。MTT試劑和Transwell小室均為美國Sigma公司產品。

1.2 細胞培養(yǎng)及轉染

人肺癌NCI-H520細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-l640培養(yǎng)液中，并置于37℃、CO2體積分數為5%及飽和濕度的溫箱中培養(yǎng)。轉染前1 d，先將細胞種于6孔板，使其在24 h內到達70% ～80%融合。加藥前30～40 min換液，加1 mL基礎培養(yǎng)基。配置siRNA 5 μL+250 μL 基礎培養(yǎng)基，lipo 2000 5 μL+250 μL培養(yǎng)基基礎室溫下靜置5 min，將上述溶液混勻，靜置20 min后將混合液逐滴均勻加入孔板，8 h后觀察，必要時換成全培養(yǎng)基，48～72 h后檢測。轉染siRNA(sense:5'-GAGCUGCGCAAGUCCAUUUTT-3')。轉染siRNANC(sense:5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3')組作為陰性對照組，未做任何處理組細胞為空白對照組。

1.3 Real-time PCR 檢測

Trizol法提取各實驗組NCI-H520細胞的總RNA，紫外分光光度計準確定量。總RNA進行反轉錄獲取cDNA后進行PCR反應。RT-PCR引物TRIM29基因正義鏈為:5'-GACATCATACCAGCCCTCGT-3';反義鏈為:5'-ATCCCGTTGCCTTTGTTGAC-3'。β-actin基因引物正義鏈為:5'-CGTCTTCCCCTCCATCGT-3';反義鏈為:5'-GAAGGTGTGGTGCCAGATTT-3'。

1.4 Western blotting 分析

細胞轉染48 h后，利用RIPA細胞裂解液(購自北京康為世紀生物科技有限公司)提取總蛋白，二辛可酸(bicinchonininc acid，BCA)試劑盒(購自江蘇碧云天生物技術有限公司)測定蛋白濃度，并調整待測樣本的蛋白質含量。每孔加50 μg的蛋白樣品，電泳、轉膜、封閉，按1∶200稀釋一抗，置4℃冰箱過夜。PBST沖洗膜3次，每次10 min，分別按1∶10 000稀釋二抗溫育l h，PBST沖洗膜3次，每次10 min。通過Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)(購自美國Licor公司)讀取目的電泳條帶的密度值。

1.5 MTT法檢測細胞增生

將各組處理后的細胞用胰蛋白酶消化，以5×103個/孔接種于96孔培養(yǎng)板.每組設6個復孔和空白對照。每孔加20 μL MTT(5 mg/mL)培養(yǎng)4 h后，棄上清，再加入二甲基亞砜每孔150 μL，于微量振蕩器充分振蕩5 min，使結晶物充分溶解。用全自動酶標儀按參比波長為470 nm測定各孔吸光度A值。

1.6 Transwell遷移實驗

采用美國Sigma公司的Transwell小室，消化6孔板中已轉染的狀態(tài)良好的NCI-H520細胞，以1×105個/孔接種于6孔培養(yǎng)板內，溫育24 h后分別加入含有空白對照或NC control或siRNA的培養(yǎng)基48 h后消化離心，調整細胞密度為4×105/mL，取0.2 mL接種到Transwell小室，并將Transwell小室置于24孔板內，上室內為含1%(質量分數)滅活血清的培養(yǎng)基，下室為含10%(質量分數)滅活血清的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后用棉簽頭擦掉小室內細胞，予90%(體積分數)甲醇固定，0.1%(質量分數)結晶紫染色，洗凈風干后于熒光倒置顯微鏡200倍視野下拍照。實驗重復3次。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0進行統(tǒng)計分析。計量數據以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用t檢驗或單因素方差分析。采用Graphpad Prism 5.0繪圖。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RT-PCR及Western blotting法檢測siRNA干擾后TRIM29基因及蛋白的表達

RT-PCR和Western blotting法分析分別檢測siRNA干擾TRIM29基因后在基因水平和蛋白水平的表達變化。結果顯示:與空白對照組、NC組相比，siRNA處理組NCI-H520細胞的TRIM29的mRNA、蛋白水平的表達量均被顯著抑制(圖1)。

2.2 siRNA降低TRIM29基因表達抑制NCI-H520細胞增生

MTT法檢測細胞增生，結果如圖2所示，與空白組及對照組比較，TRIM29 siRNA轉染組NCI-H520細胞生長明顯減慢。

2.3 siRNA降低TRIM29基因表達抑制NCI-H520細胞的遷移能力

Transwell小室法檢測細胞的遷移能力，結果如圖3所示:與空白組及對照組比較，TRIM29 siRNA轉染組NCI-H520細胞遷移能力明顯減弱。

3 討論

肺癌是目前世界上最常見的惡性腫瘤之一，雖然外科手術切除聯(lián)合化療等綜合治療已取得了明顯進步，但肺癌患者的生存率仍然不高。為了提高肺癌患者的遠期生存率，充分認識肺癌的生物學行為的分子機制具有重要作用。

圖1 轉染TRIM29 siRNA后NCI-H520細胞中TRIM29 mRNA及蛋白的表達量Fig.1 Specific downregulation of TRIM29 mRNA and protein expression by TRIM29 siRNA

圖2 MTT法檢測轉染siRNA后NCI-H520細胞的增生活性Fig.2 MTT assay used to evaluate NCI-H520 cell proliferation

TRIM29蛋白屬于三結構域(tripartite motif，TRIM)蛋白家族，含有一系列保守的鋅結合結構域:RING指結構域(R)，1型B-box和/或2型B-box結構域(B1-B2)，coiled-coil結構域(CC)［2］。TRIM29 是近年來逐漸受到關注的具有多種生物學功能的蛋白，其表達有明顯的組織和細胞特異性，多種腫瘤細胞表達明顯增高［2-4］。最近一項研究［5］表明，與周圍正常肺組織相比，TRIM29蛋白在非小細胞肺癌組織中表達增高［1］。本研究利用 RNAi技術，將特異性針對TRIM29基因的siRNA片段轉染進入肺癌NCI-H520細胞中，結果，與空白對照組及NC組相比，siRNA處理組TRIM29 mRNA和蛋白表達水平均明顯下調。此結果提示，在NCI-H520細胞中，TRIM29siRNA能夠有效、特異性地抑制TRIM29的表達。

圖3 Transwell遷移實驗檢測轉染siRNA后NCI-H520細胞的遷移能力Fig.3 Transwell assay used to determine the invasion capacity of NCI-H520 cells

近年來對TRIM29的研究發(fā)現，在某些腫瘤細胞中，TRIM29的表達與腫瘤細胞的增生及生長有關。Wang等［9］發(fā)現TRIM29蛋白可以通過激活Wnt/betacatenin通路促進胰腺癌細胞的增生。Jiang等［10］報道TRIM29蛋白在直腸癌細胞增生過程中起重要作用，干擾TRIM29蛋白的表達，可抑制直腸癌細胞的增生。Yuan等［11］證實TRIM29蛋白可以通過抑制p53的活性來促進腫瘤細胞的增生。本研究使用MTT法檢測細胞增生，與空白組及對照組比較，TRIM29 siRNA轉染組NCI-H520細胞生長明顯減慢。此結果提示，TRIM29可能參與誘導NCI-H520細胞的生長。

最近的一項研究［1］發(fā)現，在肺癌組織中，TRIM29的表達與肺癌的分期及淋巴結轉移等病理參數密切相關。進一步研究抑制TRIM29的表達對NCI-H520細胞遷移能力的影響，結果顯示與空白組及對照組比較，TRIM29 siRNA轉染組NCI-H520細胞遷移能力明顯減弱。此研究結果提示，TRIM29可能與NCI-H520細胞的遷移及侵襲能力有關。近年來的研究也發(fā)現TRIM29可能參與多種腫瘤細胞的遷移與侵襲，Jiang等［10］報道TRIM29的表達與結腸癌細胞的侵襲能力、淋巴結轉移及遠處轉移有關。Kosaka等［3］發(fā)現，在胃癌細胞中，增加TRIM29的表達，可提高腫瘤細胞的侵襲能力，并促進腫瘤細胞的淋巴結轉移。

綜上所述，本研究結果提示，RNAi技術可以有效抑制TRIM29的表達，進而抑制NCI-H520細胞的增生和遷移能力。TRIM29可能成為肺癌治療的新靶點。

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