邢卉研，王繼華，魏京燾

(哈爾濱師范大學)

0 引言

土壤微生物是衡量土壤生態(tài)環(huán)境的重要指標之一，它們參與土壤中的許多生物化學反應過程．自然界中凡是肉眼看不清楚或看不見的微小生物統(tǒng)稱土壤微生物，一般包括細菌、真菌、放線菌、古菌、原生動物、纖維藻類和病毒等［1］．微生物在土壤營養(yǎng)元素循環(huán)過程中起著十分關(guān)鍵的作用，細菌通過其自身的生理特性可引起土壤成分變化，調(diào)節(jié)土壤酸堿性等，為農(nóng)作物的生長提供營養(yǎng)［2］．

主要研究哈爾濱師范大學大豆樣地土壤微生物的種類和生理生化特性．認識土壤微生物結(jié)構(gòu)，能夠更好地發(fā)揮土壤微生物的功能，為改良土壤，提高產(chǎn)量提供科學依據(jù)，為工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)服務(wù)［3］．因此研究土壤微生物結(jié)構(gòu)的變化及微生物與生態(tài)環(huán)境之間的關(guān)系具有重要的科研和實踐意義．

1 實驗材料與方法

1．1 實驗材料

土壤樣品取自于哈爾濱師范大學大豆試驗田，采集土壤樣品裝入無菌聚乙烯袋后密封，土壤帶回實驗室立即進行土壤微生物分離，剩余土樣放入4℃冰箱進行保存．

1．2 實驗方法

1．2．1 微生物數(shù)量統(tǒng)計

土壤微生物(細菌、放線菌、真菌)的菌群數(shù)量單位為個/g干土，數(shù)量采用平板稀釋涂布方法測定．

細菌數(shù)量的測定采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，以平板表面涂抹法或平板傾注法，按公式1計算細菌數(shù)．放線菌數(shù)量測定采用改良的高氏Ⅰ號培養(yǎng)基．真菌采用鏈霉素-馬丁氏孟加拉紅培養(yǎng)基進行涂布計數(shù)．將所得數(shù)據(jù)記錄結(jié)果．

公式1:菌數(shù)=菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)/干土%

1．2．2 微生物分離、純化及鑒定

采取傳統(tǒng)微生物分離方法，對土樣的微生物進行分離、純化，進行形態(tài)觀察并記錄．對純化的細菌菌株進行生理生化試驗，包括接觸酶(過氧化氫)試驗，尿素試驗，苯丙氨酸脫氫酶試驗，糖發(fā)酵(葡萄糖、蔗糖、淀粉)試驗，甲基紅(M．R．)試驗，乙酰甲基甲醇(V．P．)試驗，淀粉水解試驗，纖維素水解試驗，吲哚試驗，檸檬酸鹽試驗和油脂水解試驗．測試細菌的對生物大分子，含C或含N化合物的利用情況，并記錄結(jié)果．

用不同的生理生化指標培養(yǎng)特征作為鑒定放線菌的依據(jù)．生理生化實驗包括:吲哚實驗、淀粉水解實驗、明膠液化實驗、產(chǎn)硫化氫實驗、牛奶石蕊實驗、糖發(fā)酵實驗(葡萄糖、乳糖、麥芽糖)．

對土壤真菌的鑒定主要依據(jù)真菌菌落特征、菌絲體特征以及孢子著生位置和形態(tài)特點．對真菌的菌落形態(tài)特征觀察并記錄．

依據(jù)經(jīng)典的微生物分類方法，對菌種的形態(tài)學特征及生理生化特征進行測定，主要依據(jù)微生物的形態(tài)學、生理學和生態(tài)學特征進行初步的分類，并參照《伯杰細菌鑒定手冊》(第八版)［4］、《微生物分類學》［5］進行鑒定．

2 實驗結(jié)果與分析

2．1 土壤中三大類微生物的數(shù)量

土壤微生物在土壤中的數(shù)量、分布與活動情況，反映了土壤肥力的高低，因此常用作評價土壤質(zhì)量，維持生產(chǎn)力、保護環(huán)境質(zhì)量以及維持系統(tǒng)健康的生物指標．

實驗對哈爾濱師范大學大豆耕地土壤微生物數(shù)量進行統(tǒng)計(見表1)．結(jié)果表明在土壤微生物三大類群微生物組成中，細菌數(shù)量占絕對優(yōu)勢，放線菌數(shù)量次之，真菌數(shù)量最少．

表1 三大類微生物在土壤中的數(shù)量組成

2．2 土壤微生物分類鑒定結(jié)果

2．2．1 細菌形態(tài)學鑒定結(jié)果

研究細菌的生理生化反應主要觀察細菌的代謝特征，對營養(yǎng)源的利用情況，生長發(fā)育條件，能否產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、產(chǎn)堿等．本次實驗共分離獲得細菌25株，生理生化實驗表明:土壤中大多數(shù)細菌不能水解油脂和明膠，多數(shù)菌種可以水解纖維素和淀粉，所得菌種均不產(chǎn)氨，多數(shù)能還原硝酸鹽，僅少數(shù)菌種能夠發(fā)酵葡萄糖、淀粉產(chǎn)酸，多數(shù)能發(fā)酵蔗糖產(chǎn)酸或既產(chǎn)酸又產(chǎn)氣，接觸酶反應、吲哚反應大部分為陽性，石蕊牛奶實驗多數(shù)產(chǎn)堿、胨化．

利用《微生物分類學》等，根據(jù)細菌的形態(tài)學特征和生理生化特征，對分離菌株進行初步的鑒定，鑒定結(jié)果(見表2)．土壤中25株細菌分別屬于12個不同菌屬:其中芽孢桿菌屬約占44%、固氮菌屬約占8%、微球菌屬及假單胞菌屬也占8%、芽孢八疊球菌屬約占4%、黃單胞菌屬占4%、鹽桿菌屬及動性球菌屬也占4%．

表2 細菌菌屬鑒定結(jié)果

2．2．2 放線菌形態(tài)學鑒定結(jié)果

放線菌主要存在于土壤環(huán)境中，絕大多數(shù)能夠產(chǎn)生抗生素，是土壤微生物重要的成員．實驗對土壤放線菌進行培養(yǎng)、分離、純化得到優(yōu)勢菌種，共分離獲得放線菌10株．放線菌的生理生化實驗主要包括:淀粉水解、接觸酶試驗、硝酸鹽還原試驗、糖發(fā)酵試驗(葡萄糖、蔗糖)．實驗表明，大部分土壤放線菌能夠產(chǎn)生過氧化氫酶，但大部分土壤放線菌不能夠水解淀粉，硝酸鹽還原反應大部分為陽性，多數(shù)放線菌能夠發(fā)酵糖類產(chǎn)酸．經(jīng)鑒定，分別屬于7個不同菌屬(見表3):鏈霉菌屬(Streptomyces)3株、羅氏菌屬(Rothia)、線桿菌屬(Bacterionema)2株、諾卡氏菌屬(Nocardia)、假諾卡氏菌屬(Pseuconocardia)、鏈孢囊菌屬(Streptosporangium)及嗜皮菌屬(Dermatophilus)．

表3 放線菌菌屬鑒定結(jié)果

2．2．3 真菌形態(tài)學鑒定結(jié)果

真菌的基本結(jié)構(gòu)為菌絲和孢子，觀察真菌孢子結(jié)果顯示，大部分真菌孢子為分生孢子，樣品中未分離出酵母菌．共分離真菌7株(見表4)，屬于青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)、根霉屬(Rhizopus)、鐮孢菌屬(Fusarium)及不產(chǎn)孢真菌(Sterile mycelia)．

表4 真菌菌屬鑒定結(jié)果

3 結(jié)束語

土壤微生物是土壤中活躍的因子之一［6］，也是土壤肥力的一個重要部分，施肥制度和施肥方式的不同將會改變土壤微生物的種群數(shù)量、結(jié)構(gòu)和活性進而對土壤肥力產(chǎn)生影響［7］．土壤中微生物數(shù)量巨大，繁殖性強，種類繁多，作用機理復雜多樣，在土壤生物的地球化學循環(huán)過程的研究中占有重要的地位［8，9］．土壤的微生物類群中，細菌數(shù)量最多，放線菌數(shù)量次之，真菌數(shù)量最少．實驗根據(jù)所分離微生物的個體特征、菌落形態(tài)特征及其生理生化特性進行初步鑒定．結(jié)果表明，土壤中25株細菌分別屬于12個不同菌屬;共分離獲得放線菌10株，分別屬于7個不同菌屬;共分離真菌7株，屬于5類不同菌屬．

該實驗旨在研究樣地土壤微生物多樣性，在后續(xù)試驗中還將對土壤酶活性、土壤理化性質(zhì)進行分析，找出微生物與土壤環(huán)境的互作關(guān)系，再進一步探討該互作關(guān)系對作物生長的影響．

［1］ Zhang P J，Zheng J F，Pan G X，et al．Changes in microbial community structure and function within particle size fractions of a paddy soilunderdifferent long-term fertilization treatments from the TaiLake region［J］．Colloids and SurfacesB，2007，58:264-270．

［2］ 鄒莉，袁曉穎，李玲，等．連作對大豆根部土壤微生物的影響研究［J］．微生物學雜志，2005，25(2)．

［3］ 楊鵬，薛立，陳紅躍，等．不同混交林地土壤養(yǎng)分，酶活性和微生物的研究．湖南林業(yè)科技，2004，31(4)．

［4］ Buchanan RE，et al．伯杰氏細菌鑒定手冊:第八版［M］．北京:科學出版社，2000．

［5］ 張紀忠．微生物分類學［M］．北京:復旦大學出版社，1990．

［6］ Dong X Z．Manual of Determinative Bacteriology［M］．Beijing:Science Press，2001．

［7］ Abbott L K，Murrphy D V．Soil Biological Fertility［M］．Nether lands:Kluwer Academic Publishers，2003．

［8］ Tied je J M，Asuming-Brem pong S，Nusslein K，et al．Opening the black box of soil microbial diversity［M］．Applied Soil Ecology，1999(13):109-122．

［9］ Girvan M S，Bullimore J，Pretty J N，et al．Soil type is the primary determinant of the composition of the total and active bacterial communities in arable soils［M］．App lied and Enviromental Microbiology，2003，69:1800-1809．