金 鑫，周 丹，于 東

(哈爾濱師范大學(xué))

0 引言

兩棲動物作為環(huán)境監(jiān)測優(yōu)良指示動物，在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用．近年來，因兩棲動物的種群數(shù)量在全球范圍內(nèi)急劇下降，關(guān)于環(huán)境污染物(農(nóng)藥、重金屬)對兩棲類毒性效應(yīng)的研究受到廣泛關(guān)注［1-4］．

工農(nóng)業(yè)和采礦業(yè)產(chǎn)生的大量重金屬通過不同途徑進入水體，在影響大型水生植物和浮游藻類的同時，對水生動物也具有一定的毒理效應(yīng)［5］．硫酸銅多年來在水產(chǎn)養(yǎng)殖的疾病防治中經(jīng)常用作消毒劑和除菌劑，進而成為一種重要的環(huán)境污染物．有關(guān)Cu2+對兩棲動物毒性的研究國內(nèi)外已有一些報道，涉及到蟾蜍科的毗刺蟾蜍(Bufo juxtasper)、中華大蟾蜍(Bufo gargarizans)、花背蟾蜍(Bufo raddei)、黑眶蟾蜍(Bufo melanostictus)和綠蟾蜍(Bufo viridis);負(fù)子蟾科的光滑爪蟾(Xenopus laevis)和非洲爪蟾(Xenopus laevis);蛙科的牛蛙(Rana catesbeiana)、黑斑蛙(Rana nigormaculata)、澤蛙(Rana limnocharis)、日本林蛙(Rana japonica)和中國林蛙(Rana chensinensis)等兩棲類蝌蚪的毒性研究［6-19］．目前還沒有關(guān)于重金屬對東北林蛙毒性作用的相關(guān)報道．

該研究以東北林蛙蝌蚪為研究對象，用不同濃度的Cu2+處理東北林蛙蝌蚪，觀察其毒性效應(yīng)，統(tǒng)計并計算半致死濃度(LC50)和安全濃度(SC)．以期為人工養(yǎng)殖、環(huán)境保護和治理提供研究材料的同時，也為兩棲動物的資源保護提供理論依據(jù)．

1 材料和方法

1．1 實驗材料

實驗材料為野生東北林蛙，種蛙采自黑龍江省尚志市帽兒山地區(qū)．在實驗室內(nèi)抱對、產(chǎn)卵和孵化，采用孵化出的同一批蝌蚪，待出膜后發(fā)育至33～35期［20］時挑選體質(zhì)健康、大小一致的個體進行毒性實驗．實驗開始時受試蝌蚪的平均體重為0．102 ±0．018 g，平均體長(從吻端至尾端)為13．76 ± 0．213mm。

所用染毒試劑為CuSO4·5H2O，分析純，西安化學(xué)廠生產(chǎn)．用蒸餾水配成1500 mg/L Cu2+母液，實驗用水為曝氣2 d以上的自來水(pH保持在 6．8 ～ 7．0)，采用 39．5 cm × 28．5 cm ×10 cm的塑料方盆作為容器，實驗期間水溫保持在18～24℃之間．

1．2 實驗方法

1．2．1 預(yù)實驗

預(yù)實驗在較大的 Cu2+濃度范圍進行，通過預(yù)實驗找出最小的全致死濃度和最大的零致死濃度，然后根據(jù)預(yù)實驗所得出的質(zhì)量濃度范圍來確定正式實驗的濃度范圍．

1．2．2 正式實驗

正式實驗采用有毒物質(zhì)對水生生物急性毒性實驗的標(biāo)準(zhǔn)方法［21］．在100%死亡濃度與無死亡濃度范圍內(nèi)設(shè)7個 Cu2+質(zhì)量濃度組，分別為0．01、0．06、0．1、0．3、0．5、1．5 和 2．5 mg/L，另設(shè)一個空白對照組，整個實驗設(shè)3個平行組．每個實驗容器盛試液2000 ml，隨機放入大小一致的蝌蚪13只，隔24 h換液一次．及時觀察和記錄蝌蚪的中毒癥狀，并記錄24 h、48 h、72 h和96 h的死亡數(shù)量(死亡標(biāo)準(zhǔn)以觸及身體不再有反應(yīng)為準(zhǔn))，隨時清出死亡個體．

1．2．3 數(shù)據(jù)處理

用處理濃度對數(shù)與個體死亡率概率單位的關(guān)系進行回歸分析，得到回歸方程，分別計算24、48、72 和96 h 的半致死濃度(LC50)，并采用公式:48 h半致死濃度×0．3/(24 h半致死濃度/48 h半致死濃度)2計算安全濃度［22］．P＜0．01，被認(rèn)為有極顯著相關(guān)．統(tǒng)計分析采用SPSS 12．0數(shù)據(jù)分析軟件．

2 結(jié)果

2．1 蝌蚪的中毒與死亡癥狀

通過4 d的觀察，東北林蛙的蝌蚪在不同濃度的Cu2+溶液中都出現(xiàn)了不同程度的中毒現(xiàn)象．在較低濃度組中，中毒癥狀出現(xiàn)的較慢，開始表現(xiàn)出自由游泳的姿態(tài)，但幾小時后，游動的頻率和能力則有所下降．而在較高濃度組，中毒癥狀表現(xiàn)得比較快而且強烈．但二者的癥狀相似:中毒后，蝌蚪表現(xiàn)不安，游動劇烈，隨后身體失去平衡、游動方式雜亂，身體彎曲，最后反應(yīng)遲鈍，臥于水底不動，用玻璃棒觸之，尾部劇烈顫抖，最后死亡，死亡個體尾部上翹呈脫水狀．

2．2 暴露濃度、暴露時間與死亡率的關(guān)系

在水溫18～24℃條件下，Cu2+對東北林蛙蝌蚪的急性毒性實驗結(jié)果如表1所示．在暴露24 h和48 h時，0．06 mg/L組蝌蚪出現(xiàn)死亡，1．5 mg/L組蝌蚪全部死亡．在暴露 72 h時，0．01 mg/L組蝌蚪出現(xiàn)死亡，0．5 mg/L 組蝌蚪全部死亡．在暴露96 h時，蝌蚪全部死亡的濃度降低為 0．3 mg/L．

根據(jù)表1的實驗結(jié)果，將累計死亡百分率轉(zhuǎn)化為死亡幾率單位，Cu2+的質(zhì)量濃度轉(zhuǎn)化為濃度對數(shù)，經(jīng)回歸統(tǒng)計分析，得出其死亡幾率單位與濃度對數(shù)變化呈線性相關(guān)(表2)．

由回歸方程可求出Cu2+對東北林蛙蝌蚪作用24 h、48 h、72 h和96 h的半致死濃度(LC50)分別為 0．189、0．118、0．058 和 0．027 mg/L，安全濃度為0．022 mg/L．

表1 不同質(zhì)量濃度Cu2+處理東北林蛙蝌蚪的累計死亡數(shù)和死亡率

表2 Cu2+濃度對數(shù)與東北林蛙蝌蚪死亡幾率之間關(guān)系的回歸統(tǒng)計

3 討論

從Cu2+對東北林蛙蝌蚪的急性毒性實驗結(jié)果可見，在同一時間內(nèi)隨著Cu2+質(zhì)量濃度的升高蝌蚪的死亡率逐漸升高，說明在一定濃度范圍內(nèi)，蝌蚪死亡率與Cu2+呈正相關(guān)．在同一濃度下隨著染毒時間的延長蝌蚪的死亡率也逐漸增高，說明死亡率與 Cu2+暴露時間呈正相關(guān)，證明Cu2+對東北林蛙的毒性作用是隨著體內(nèi)Cu2+積累量的增加而增強的．在Cu2+對其他兩棲類的毒性研究中也得到了類似的結(jié)果，Khangarotdeng等報道 Cu2+對黑眶蟾蜍的 24 h、48 h、96 h LC50值分別為 0．843、0．446、0．32 mg/L［19］;Rao 等報道Cu2+對飾紋姬蛙的24 h、48 h、72 h 、96 h LC50值分別為 5．4、5．0、4．8、4．7 mg/L［23］;Khangarot等報道 Cu2+對六趾蛙的 24 h、48 h、72 h 、96 h LC50值分別為 0．55、0．048、0．043、0．043 mg/L［24］;汪學(xué)英等報道Cu2+對黑斑蛙的96 h LC50值分別為 0．206 mg/L［9］;賈秀英等報道 Cu2+對澤蛙蝌蚪24 h、48 h、96 h LC50值分別為 0．98、0．70 和0．43 mg/L［10］;盧祥云等報道 Cu2+對中華大蟾蜍蝌蚪 24h、48h的半致死濃度分別為1．310 mg/L、0．862 mg/L［12］;姚丹等報道 Cu2+對日本林蛙蝌蚪24 h、48 h、72 h 、96 h LC50 分別為0．250、0．143、0．117、0．102 mg/L［13］;石戈等報道 Cu2+對中國林蛙蝌蚪 24 h、48 h、72 h LC50值分別為 0．131、0．105、0．038 mg/L［14］．

毒性回歸方程的截距(b值)表示受試動物對外界污染物敏感性的異質(zhì)程度［25］．96 h回歸方程的b值為8．066．表明蝌蚪對Cu2+的異質(zhì)性很小，即當(dāng)Cu2+達到一定濃度后，若濃度再稍有提高，將會迅速引起大量死亡．從本實驗可見，Cu2+濃度從0．06增至0．5 mg/L時，蝌蚪的死亡率提高了約53．9%，說明東北林蛙蝌蚪群體對Cu2+的異質(zhì)性小，敏感性強．另外，隨著暴露時間的增長，b值增大．說明隨著蝌蚪對Cu2+暴露時間的延長，群體的異質(zhì)性減小，即個體的敏感程度更加接近［12］．在該實驗中，回歸方程的b值隨著時間的延長，呈逐漸增大的趨勢，說明隨著Cu2+染毒時間的延長，蝌蚪群體對Cu2+的敏感度在增強．顯示在長期染毒條件下，較低濃度的Cu2+將可以對東北林蛙蝌蚪產(chǎn)生毒性效應(yīng)．根據(jù)我國地面水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，Ⅴ類水域(即農(nóng)業(yè)用水區(qū)及一般景區(qū)要求水域)的總銅含量在1．0 mg/L以下，尤其是在林蛙養(yǎng)殖中普遍使用0．7 mg/L硫酸銅來進行常規(guī)的病害防治［26］，該濃度超出了東北林蛙蝌蚪24 h LC50值0．189mg/L和安全濃度0．022 mg/L．所以在東北林蛙蝌蚪期不宜使用硫酸銅來進行病害防治．上述Cu2+對其他兩棲類的半致死濃度也低于硫酸銅的常用處理濃度．因此，在東北林蛙及其他兩棲類的養(yǎng)殖和棲息地區(qū)對水中的Cu2+進行準(zhǔn)確檢測具有重要意義．

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