何杰

（ 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214081）

孫興馳，隋東海

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無(wú)錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214081）

淡水石斑魚(yú)（Cichlasoma managuense）隸屬鱸形目（Perciformes）鱺魚(yú)科（Cichlaidae）麗體魚(yú)屬（Cichlasoma），原產(chǎn)于中美洲，屬名貴魚(yú)類(lèi)，1988年引入臺(tái)灣，1996年從臺(tái)灣引入大陸，成為淡水養(yǎng)殖的一個(gè)新品種［1］。目前，淡水石斑魚(yú)在重金屬毒性試驗(yàn)［2－3］、含肉率和肌肉營(yíng)養(yǎng)成分分析［4］、血細(xì)胞發(fā)生的觀察［5］、人工繁殖［6］、養(yǎng)殖［7－8］及病害防治［9］等方面已有一些研究，但其胚胎發(fā)育尚未見(jiàn)報(bào)道，而且麗體魚(yú)屬中也未見(jiàn)有胚胎發(fā)育方面的報(bào)道，但鱺魚(yú)科中尼羅羅非魚(yú)（Oreochrimis nilotica）［10－12］、莫桑比克羅非魚(yú)（Oreochrimis mossambca）［13］、盤(pán)麗魚(yú)（Symphysodon discus ）［14］、神仙魚(yú)（Pterophyllums carale）［15］的胚胎發(fā)育均有報(bào)道。本研究探討了淡水石斑魚(yú)胚胎發(fā)育的特征，以為魚(yú)苗的繁殖培育、品種改良提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 親魚(yú)的來(lái)源及培育

2010年6月從福建漳州購(gòu)入一批淡水石斑魚(yú)水花，在淡水漁業(yè)研究中心宜興實(shí)驗(yàn)基地養(yǎng)殖，2012年5月從越冬池中選擇個(gè)頭較大、身體強(qiáng)壯的雌雄魚(yú)各100尾，雌雄分開(kāi)在溫室內(nèi)進(jìn)行強(qiáng)化培育。

1.2 親魚(yú)的挑選及人工催產(chǎn)

在7月初，挑選腹部發(fā)白、膨大明顯、顏色較淡的雌魚(yú)和體色鮮艷、身體強(qiáng)壯的雄魚(yú)，單尾重300～400g。在溫室內(nèi)進(jìn)行人工繁殖，20：00時(shí)注射催產(chǎn)素，雌魚(yú)每千克體重注射腦垂體1.5～3mg＋HCG 800～1000IU；雄魚(yú)劑量減半。注射后的雌、雄親魚(yú)用網(wǎng)箱分開(kāi)放，池內(nèi)充氣增氧，DO為8mg／L左右，水溫28℃。清晨5：00時(shí)，將4尾雌魚(yú)、6尾雄魚(yú)放入同一只網(wǎng)箱，讓其自然交配。此時(shí)，留人靜候觀察，發(fā)現(xiàn)雌魚(yú)產(chǎn)卵受精時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，進(jìn)行胚胎發(fā)育觀察。淡水石斑受精卵呈粘性，成片附著在網(wǎng)箱的網(wǎng)片上，剛產(chǎn)出為白色，遇水不久變?yōu)楣鉂傻乃?。結(jié)果交配的3只網(wǎng)箱，均有產(chǎn)卵。

1.3 樣本取樣和觀察

在水面下向網(wǎng)箱內(nèi)輕折附有受精卵的網(wǎng)片時(shí)有許多卵粒脫落，用潔凈培養(yǎng)皿取得脫落卵粒，然后在Olympus生物顯微鏡下觀察胚胎發(fā)育，并連接電腦放大成像。輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，立體觀察，詳細(xì)記錄不同時(shí)間的發(fā)育特征，同時(shí)進(jìn)行顯微攝影。觀察環(huán)境水溫（25.7±0.3）℃，每2h換水1次以保持胚胎正常發(fā)育。

2 結(jié)果與分析

在水溫（25.7±0.3）℃的環(huán)境中，淡水石斑魚(yú)的胚胎發(fā)育從受精卵開(kāi)始至早期魚(yú)苗，歷時(shí)達(dá)56h，其中的35個(gè)階段顯著特征詳見(jiàn)表1。其胚胎發(fā)育過(guò)程可劃分為8個(gè)時(shí)期：胚盤(pán)形成期、卵裂期、囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期、器官形成期、出膜期、卵黃期。

表1 淡水石斑魚(yú)胚胎發(fā)育期及其特征

2.1 胚盤(pán)形成期

淡水石斑魚(yú)受精卵為橢圓形，短軸（1.19±0.11）mm，長(zhǎng)軸（1.51±0.13）mm，半透明，卵黃囊占據(jù)絕大部分體積，可見(jiàn)卵黃顆粒，動(dòng)物極淺紅色（圖1－1）。受精幾分鐘后，動(dòng)物極顏色逐漸變深同時(shí)隆起形成胚盤(pán)（圖1－2），至32min后，胚盤(pán)高度不再變化并積累營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為卵裂作好準(zhǔn)備（圖1－3）。

2.2 卵裂期

受精后41min，卵裂開(kāi)始發(fā)生，僅在動(dòng)物極的胚盤(pán)正中央出現(xiàn)直線狀淡色溝，并逐漸加深，胚盤(pán)一分為二（圖1－4），然后兩側(cè)分別收縮并隆起，至1h9min時(shí)，形成2個(gè)大小均一饅頭狀細(xì)胞，完成第1次卵裂（圖1－5）；第2～4卵裂與第1次分裂方向垂直。至1h20min完成第2次分裂，形成形狀大小一致的4個(gè)分裂球進(jìn)入4細(xì)胞期（圖1－6）；分裂球的中部逐漸形成縊痕，至1h47min完成第3次分裂，形成8個(gè)形狀大小基本一致的分裂球進(jìn)入8細(xì)胞期（圖1－7）；第4次出現(xiàn)不同步分裂，有的細(xì)胞已分開(kāi)，有的還連接在一起，形狀大小也產(chǎn)生差異，至2h2min完成第4次分裂進(jìn)入16細(xì)胞期（圖1－8）；至2h19min完成第5次分裂，進(jìn)入32細(xì)胞期，細(xì)胞分裂呈不規(guī)則兩層，細(xì)胞大小也不盡相同（圖1－9）；至2h48min細(xì)胞又完成第6次分裂，細(xì)胞顯著減小，進(jìn)入64細(xì)胞期（圖1－10）；細(xì)胞越分越細(xì)，位于中央部分細(xì)胞分裂較快，長(zhǎng)方形細(xì)胞團(tuán)變成半球形，至3h14min進(jìn)入多細(xì)胞期（圖1－11）；細(xì)胞分裂至3h49min時(shí)，細(xì)胞密集但仍可見(jiàn)單個(gè)細(xì)胞，隨后分裂細(xì)胞團(tuán)四周收縮，高度逐漸增加，進(jìn)入桑葚期（圖1－12）。

2.3 囊胚期

受精后4h55min進(jìn)入囊胚期，細(xì)胞分裂更細(xì)，難以見(jiàn)到單個(gè)細(xì)胞，層數(shù)不斷增加疊起，最終呈僧帽狀的高囊胚期（圖1－13）；接著僧帽狀邊沿向下鋪展，囊胚細(xì)胞向四周延伸，囊胚高度逐漸降低，至5h57min類(lèi)似早期胚盤(pán)（四周與卵黃交界處有亮環(huán)而與胚盤(pán)相異），進(jìn)入平囊胚期（圖1－14）。

2.4 原腸胚期

受精后7h16min進(jìn)入原腸胚早期，囊胚細(xì)胞開(kāi)始從動(dòng)物極下包植物極，可見(jiàn)囊胚腔和早期胚環(huán)（圖1－15），下包至1／5處時(shí)胚環(huán)顯著，囊胚腔縮小（圖1－16）；至8h23min下包至1／2處，形成原腸胚中期，可見(jiàn)胚盾，胚盾始于動(dòng)物極止于胚環(huán)（圖1－17）；在繼續(xù)下包過(guò)程中，胚環(huán)形成的縊痕逐漸加深，胚盾顯著增粗并與胚環(huán)一起下移并延伸（圖1－18），至9h48min下包至2／3處，胚盾顏色開(kāi)始轉(zhuǎn)淡，下包過(guò)程中卵黃囊被擠而部分凸出胚環(huán)外，進(jìn)入原腸胚后期（圖1－19）；至10h50min下包至4／5，進(jìn)入原腸胚末期，卵黃囊小部分被擠而突出形成泡狀（圖1－20）。

2.5 神經(jīng)胚期

受精卵發(fā)育至11h47min時(shí)出現(xiàn)神經(jīng)胚，胚體頭部增高，出現(xiàn)腦泡，初現(xiàn)胚體輪廓，卵黃囊即將被包完，部分卵黃凸出似脫痣狀卵黃栓（圖1－21）；發(fā)育至11h52min，胚孔即將封閉，呈火山狀，胚體頭前端有細(xì)管連接。胚體索狀，向外凸出卵膜外成脊，向內(nèi)擠壓卵黃囊成溝（圖1－22）；至13h19min，神經(jīng)胚頭端抬起，出現(xiàn)體節(jié)，黑色素開(kāi)始大量出現(xiàn)，體節(jié)延伸到植物極底端（圖1－23）。

2.6 器官形成期

2.6.1 泡形成期

受精后16h23min，尾部出現(xiàn)透明小泡，介于卵膜與卵黃囊之間，體節(jié)較粗壯，視芽（視泡前身）可見(jiàn)（圖1－24）；至21h11min，胚體扭動(dòng)，胚尾扭轉(zhuǎn)，掙脫膜的束縛，在卵膜與卵黃囊之間露出游離空間（圖1－25），進(jìn)入尾芽期；至23h9min，胚體頭部?jī)蓚?cè)出現(xiàn)隆起形成泡狀，進(jìn)入視泡期（圖1－26）；至27h43min，視泡后出現(xiàn)較小泡狀物為聽(tīng)泡，此時(shí)胚體頭前端有一小管連接，可見(jiàn)管內(nèi)流動(dòng)淡紅色液體（圖1－27）。至30h36min出現(xiàn)腦泡，胚體頭部初具魚(yú)苗頭部輪廓，卵黃囊上開(kāi)始出現(xiàn)黑色素顆粒（圖1－28）。

2.6.2 心臟期

受精后34h29min為心臟前期，出現(xiàn)透明狀管泡狀物即心芽，胚體頭前端管狀物粗大，管內(nèi)液體流動(dòng)速度很快不易察覺(jué)，動(dòng)物極下的卵黃過(guò)分吸收具明顯缺刻（圖1－29、圖1－30），胚體頭部進(jìn)一步發(fā)育體積增大近1倍（圖1－30）；至38h37min，可見(jiàn)圓環(huán)形晶體輪廓（圖1－31），晶體環(huán)由不同的弧形小片組成；至38h56min為心臟中期，胚體頭前端管膨大呈囊狀，鑲嵌于卵黃囊上，可見(jiàn)有液體從卵黃囊四周流向胚體頭部（圖1－32，1－33）；至43h26min，胚體異?；钴S有力，胚體長(zhǎng)度為此時(shí)卵徑周長(zhǎng)的3／4，在卵黃囊與卵膜之間間歇性擺動(dòng)4～5秒扭動(dòng)1次，卵黃囊被擠壓呈不同形狀（圖1－34）；至47h 39min為心臟后期，心臟跳動(dòng)有力，心率為38，胚體頭前端囊狀管液體流呈紅色（圖1－35）。

2.6.3 血液循環(huán)期

受精后48h53min進(jìn)入血液循環(huán)前期，囊狀管向卵膜一端分出4分支小管，為血液流出方向，可見(jiàn)小管內(nèi)有快速流動(dòng)的血液（圖1－36、1－37）；至49h58min為血液循環(huán)后期，可見(jiàn)囊狀管向卵黃囊一端有4支粗管，為血液流入方向，小管內(nèi)血液顏色較鮮艷，心率增加至53（圖1－38、1－39）。

2.7 孵化出膜

受精后52h24min，胚體運(yùn)動(dòng)擠壓卵黃囊，囊狀管被埋入卵黃囊內(nèi)，尾尖處卵膜首先瞬間爆裂，內(nèi)容物和卵黃苗被彈出（圖1－40）。至56h53min，為卵黃苗前期，魚(yú)苗呈彎曲狀，身體前部附著在卵黃囊上（圖1－41）；至77h46min，為卵黃苗后期，魚(yú)苗身體平直透明，游動(dòng)有力，卵黃囊顯著縮小（圖1－42）。魚(yú)苗孵出后會(huì)擠在一起尾部朝同一方向不斷擺動(dòng)，形成微環(huán)循水體，此后進(jìn)入親魚(yú)護(hù)崽階段。

3 討論

淡水石斑魚(yú)屬分批產(chǎn)卵熱帶魚(yú)類(lèi)，在繁殖季節(jié)很難判斷雌魚(yú)體內(nèi)卵子發(fā)育的成熟情況，繁殖前雌雄分開(kāi)進(jìn)行強(qiáng)化培育十分必要，否則人工繁殖較難獲得成功。孵化水溫對(duì)魚(yú)苗繁殖具有重要意義，從48種魚(yú)類(lèi)平均溫度和發(fā)育時(shí)間來(lái)看，平均溫度增高，發(fā)育時(shí)間縮短［16］，如冷水性魚(yú)類(lèi)山女鱒（Oncorhynchus masou masou）低于4℃比8℃時(shí)的孵化時(shí)間要長(zhǎng)30d［17］，淡水石斑魚(yú)在水溫26～29℃時(shí)，48h可孵出仔魚(yú)［1］。本研究采用孵化水溫近26℃，孵化時(shí)間為56h，孵化水溫還有提升的空間。

淡水石斑魚(yú)胚胎發(fā)育從第4次分裂起，分裂相細(xì)胞排列趨向紊亂，不如泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）［18］、胭脂魚(yú)（Myxocyprinus asiaticus）［16］等魚(yú)類(lèi)分裂細(xì)胞排裂整齊。受精卵外觀和發(fā)育與同科的盤(pán)麗魚(yú)胚胎發(fā)育較為近似［14］，與同科的羅非魚(yú)相比，后者受精卵為卵圓形，動(dòng)物極較尖，淡黃色不會(huì)遇水變得透明，發(fā)育過(guò)程中的血管系統(tǒng)也不如淡水石斑魚(yú)發(fā)達(dá)［10－12］。

淡水石斑魚(yú)胚胎發(fā)育形成了較為復(fù)雜的胚胎血液環(huán)循系統(tǒng)，其卵黃囊較軟，胚環(huán)的下移和胚體的活動(dòng)都能輕易改變其形狀，這些特征與運(yùn)動(dòng)相關(guān)因此需氧量也相對(duì)較高，所以淡水石斑魚(yú)胚胎發(fā)育耗氧較高，所以有親魚(yú)護(hù)卵習(xí)性，用鰭扇動(dòng)水流，從而增加氧氣，否則受精卵會(huì)發(fā)白，不久即死亡。

在心臟形成中、后期，胚體頭部端管膨大成囊狀，內(nèi)部流動(dòng)著無(wú)色液體也轉(zhuǎn)化為淡血色至鮮紅色，囊狀物類(lèi)似心臟，但無(wú)搏動(dòng)現(xiàn)象，末起到心臟搏動(dòng)提供動(dòng)力作用，后來(lái)其發(fā)育去向不明，其原因還需要做進(jìn)一步研究。同時(shí)在心臟中、后期和出膜前期，胚體也異?；钴S，對(duì)環(huán)境條件的變化也比較敏感，通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)，此階段如從25.7℃降至18℃，出膜后的魚(yú)苗出現(xiàn)水泡胸，不久死亡。幼苗破膜而出同時(shí)伴有大量的廢物質(zhì)釋放，水質(zhì)易惡化，所以在受精卵在出膜階段，適宜的水溫和豐富的溶氧有利于幼苗成活和正常發(fā)育。

［1］劉永華，周海平，沈衛(wèi)紅.淡水石斑魚(yú)的生物學(xué)特性與養(yǎng)殖技術(shù) ［J］.廣西水產(chǎn)科技，2000，（4）：23－25.

［2］何斌，何利君，杜軍，等.4種重金屬離子對(duì)淡水石斑胚胎及仔魚(yú)急性毒性的研究 ［J］.水利漁業(yè)，2006，26（4）：94－95，106.

［3］段彪，黃文清.4種重金屬離子對(duì)淡水石斑胚胎及仔魚(yú)的毒性試驗(yàn) ［J］.南方農(nóng)業(yè)，2008，2（7）：19－20.

［4］黃海，楊寧，張希.淡水石斑魚(yú)含肉率和肌肉營(yíng)養(yǎng)成分分析 ［J］.水產(chǎn)科技情報(bào)，2012，39（2）：87－91.

［5］顧曙余，杜寅，丁力，等.淡水石斑外周血細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)觀察 ［J］.動(dòng)物學(xué)雜志，2007，42（6）：115－119.

［6］黃薇，周文玉，張富樂(lè).淡水石斑魚(yú)人工繁殖技術(shù)研究 ［J］.水產(chǎn)科技情報(bào)，2003，30（3）：106－108.

［7］陳迪虎.淡水石斑魚(yú)的溫室養(yǎng)殖試驗(yàn) ［J］.水產(chǎn)科技情報(bào)，2006，33（1）：15－16.

［8］吳震亮.淡水石斑魚(yú)的網(wǎng)箱養(yǎng)殖技術(shù) ［J］.福建農(nóng)業(yè)，2012，（5）：29.

［9］馬懷忠.淡水石斑魚(yú)常見(jiàn)病害及防治 ［J］.漁業(yè)致富指南，2010，（20）：47－48.

［10］王令玲，仇潛如.尼羅羅非魚(yú)胚胎及胚后發(fā)育的觀察 ［J］.動(dòng)物學(xué)報(bào)，1981，27（4）：327－335.

［11］劉筠，劉國(guó)安，陳淑群，等.尼羅羅非魚(yú)性腺發(fā)育的研究 ［J］.水生生物學(xué)集刊，1983，8（1）：17－32.

［12］Fujimura K，Okada N.Development of the embryo，larva and early juvenile of Nile tilapia Orechromis niloticus（Pisces：Cichidae）Developmental staging system ［J］.Development，growth ＆differentiation，2007，49：301－324.

［13］王楚松.羅非魚(yú)的養(yǎng)殖 ［M］.北京：農(nóng)業(yè)出版社，1981.

［14］童永，沈建忠.盤(pán)麗魚(yú)胚胎發(fā)育的研究 ［J］.安微農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（7）：2633－2635.

［15］周玉，楊振國(guó)，張俊輝.神仙魚(yú)胚胎和仔魚(yú)發(fā)育的初步觀察 ［J］.上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，7（4）：370－373.

［16］萬(wàn)遠(yuǎn)，占陽(yáng)，歐陽(yáng)珊，等.胭脂魚(yú)胚胎及仔魚(yú)早期發(fā)育觀察 ［J］.南昌大學(xué)學(xué)報(bào)（理科版），2013，37（1）：78－82.

［17］范兆廷，姜作發(fā)，韓英.冷水性魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖學(xué) ［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2008.

［18］ZHANG Yu－ming，TIAN Xiu－e，WANG Yong－jun.Research on Embtyonic Development of loach ［J］.Agricultural Science ＆Technology，2010，11：125－128.