周玉燕，沈子龍

(1.皖南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 蕪湖 241002;2.中國藥科大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210009)

多糖鐵復(fù)合物(polysaccharide iron complex，PIC)是臨床上用于治療單純性缺鐵性貧血的第三代生物補(bǔ)鐵劑，由于多糖鐵復(fù)合物與鐵離子絡(luò)合的配體是生物大分子多糖，不僅克服了二代補(bǔ)鐵劑胃腸刺激的副作用，釋放的不同配體多糖還具有各種生物功能，如補(bǔ)血、抗腫瘤、抗輻射、抗氧化等［1］，成為目前研究的熱門。研究人員以多種大分子多糖為配體合成多糖鐵復(fù)合物如:滸苔多糖鐵、厚樸葉多糖鐵、百合多糖鐵、當(dāng)歸多糖鐵、玉米多糖鐵、大豆多糖鐵等［2－8］，在這些多糖鐵中，玉米多糖鐵(CPIC)以其較高的含鐵量和生物利用度，成為具有廣泛應(yīng)用前景的補(bǔ)鐵劑。本課題組先前研究了玉米多糖鐵在SD大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)過程，發(fā)現(xiàn)服用后能夠顯著提高血液中鐵離子濃度，具有很好的補(bǔ)血效果。為了進(jìn)一步研究玉米多糖鐵的藥效學(xué)，本研究采用原子吸收分光光度法對玉米多糖鐵在畢格犬體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征進(jìn)行研究，以期為新藥申報(bào)提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)資料和參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)室自制玉米多糖鐵溶液，規(guī)格8 mg/ml;鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液，江蘇省疾控中心提供，編號GBW(E)080378，質(zhì)量濃度 1.08 mg/ml;三氟乙酸(分析純)，鹽酸(分析純)，0.9%氯化鈉注射用水等均由南京化學(xué)試劑有限公司提供;AA-670型原子吸收分光光度計(jì)，shimadzu公司提供;TGL-16型高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;畢格犬12只(普通級)，上海市新岡實(shí)驗(yàn)動物場，許可證號:SCXK(滬)2002-14。

1.2 玉米多糖鐵的制備 參考文獻(xiàn)［8］，制備玉米多糖鐵溶液。得到玉米多糖鐵溶液的含量為8 mg/ml，經(jīng)亞鐵氰化鉀檢測，溶液中無游離鐵。鄰菲羅啉比色法［9］測定其鐵含量46%。

1.3 直接火焰原子分光光度法［10］測定畢格犬血漿中鐵含量的方法學(xué)考察

1.3.1 犬血樣的處理及標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 分別準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)鐵溶液(含鐵20 μg/ml)適量，用犬血漿稀釋，然后用1 mol/L HCl處理，經(jīng)85～95℃水浴2～3 min后，用20%的三氟乙酸沉淀，離心后得到鐵含量為 5.0、3.0、1.5、1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作液系列備用。

1.3.2 樣品在血漿中回收率、精密度和穩(wěn)定性測定 ①精密度及準(zhǔn)確度:取標(biāo)準(zhǔn)鐵溶液(含鐵20 μg/ml)，用犬血清稀釋至 5.0、1.0、0.2 μg/ml三個(gè)濃度的工作液各5份，然后用1 mol/L HCl處理，經(jīng)85～95℃水浴2～3 min后，用20%的三氟乙酸沉淀，12 000 r/min 10 min后取上清，原子吸收分光光度法測A值，計(jì)算日內(nèi)精密度及回收率。每日重新配制5.0、1.0、0.2 μg/ml三個(gè)濃度的工作液，同上法處理測定，連續(xù)測定5 d，計(jì)算日間精密度。②穩(wěn)定性考察:制備 5.0、1.0、0.2 μg/ml三個(gè)濃度的工作液各5份，處理后得到質(zhì)控溶液分別考察其在室溫放置0 ～24 h，取 0、10、24 h，測 3 次;－20 ℃ 儲存，隔日各濃度各取出1管測定。于－20℃保存24 h，取出置室溫自然解凍。將其中1組處理后測定吸光度;剩余其他樣品放回冷凍狀態(tài)保持24 h，如此解凍-冷凍重復(fù)循環(huán)兩次以上。測定吸光度。穩(wěn)定性結(jié)果以殘余百分?jǐn)?shù)表示，計(jì)算公式為:

1.4 多糖鐵在畢格犬中的藥代動力學(xué)參數(shù)測定畢格犬12只，隨機(jī)分為3組，雌雄各半，禁食，自由飲水。分別灌胃給予高劑量(11 mg/kg)，中劑量(5.7 mg/kg)，低劑量(2.9 mg/kg，)。灌胃給藥各組在給藥后 5 min、15 min、30 min、60 min、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、16 h 及 24 h，通過靜脈采血 3 ml，肝素抗凝，3 000 r/min離心20 min取血漿，－20℃保存?zhèn)溆谩Ｈ?.6 ml的犬血漿，加入1 mol/L的HCl 0.3 ml，在85～95℃下水浴2～3 min。然后加入20%的三氟乙酸沉淀，12 000 r/min離心10 min后取上清。原子吸收分光光度法測其A值。

1.5 數(shù)據(jù)處理 本次試驗(yàn)藥代動力學(xué)參數(shù)的計(jì)算采用 drug and statistics for windows(DAS，2.0 版)藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)處理軟件，根據(jù)非房室模型對數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性 用原子吸收分光光度法測定犬血漿中的鐵濃度時(shí)，當(dāng)鐵濃度在0.2～5 μg/ml范圍內(nèi)時(shí)線性良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù) r=0.999 6 ～0.999 9，定量限為 0.2 μg/ml。

2.2 精密度考察 測得玉米多糖的低、中、高三種質(zhì)量濃度分別為 5.0、1.0 和 0.2 μg/ml時(shí)，用原子吸收分光光度法測得的日內(nèi)精密度分別為:0.36%、1.68% 和 10.40%;日間精密度分別為:3.98%、6.94%和 14.32%;提取回收率分別為 109.05%、108.12%、91.60%?；厥章逝c精密度均良好，符合國家對生物樣品測定的要求。結(jié)果見表1。

表1 玉米多糖鐵的平均回收率及精密度(n=5)Tab 1 Precision and recovery rate for CPIC

2.3 穩(wěn)定性考察 表2為室溫放置24 h、－20℃保存以及反復(fù)凍溶條件下穩(wěn)定性考察的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果表明，多次測定樣品的準(zhǔn)確度均在89.6% ～102.8%，說明樣品含量沒有發(fā)生明顯的變化，在冷凍放置、凍融、以及處理后室溫放置的條件下，樣品較穩(wěn)定。

表2 玉米多糖鐵的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Stability for corn PIC

2.4 多糖鐵在犬中藥代動力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果 玉米多糖鐵在畢格犬體內(nèi)的血藥濃度與時(shí)間曲線見圖1，玉米多糖鐵的藥代動力學(xué)參數(shù)見表3。由圖表比較可以看出，口服灌胃給藥后，玉米多糖鐵在畢格犬內(nèi)的藥代動力學(xué)行為符合二房室模型特征，玉米多糖鐵在畢格犬體內(nèi)的末端消除半衰期Tz1/2在高、中、低劑量時(shí)分別為(1.69 ±0.25)×103、(1.4 ±0.51)×103和(1.88 ±1.41)×103min;AUC0－∞分別為(5.87 ±1.39)×103、(4.53 ±1.11)×103和(3.91 ±2.12)×103mg/(L·min)。AUC0－∞與劑量間呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù) r=0.9994(P ＜0.05，t=8.27)。且t1/2、tmax和MRT等參數(shù)不隨給藥劑量的增加而改變。表明玉米多糖鐵在犬體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄均為一級動力學(xué)過程，玉米多糖鐵的吸收、消除速率呈現(xiàn)為劑量非依賴性。

表3 畢格犬灌胃給予不同劑量的多糖鐵后的藥代動力學(xué)參數(shù)Tab 3 Pharmacokinetic parameter for corn PIC in different dosage

圖1 畢格犬給予不同劑量多糖鐵后其血漿中鐵濃度-時(shí)間關(guān)系曲線Fig 1 Concentration and time curve for corn PIC administered by different dosage in the beagle dogs

3 討論

近年來多糖鐵復(fù)合物在缺鐵性貧血的臨床應(yīng)用中越來越廣泛，其中，力蜚能是多糖鐵復(fù)合物產(chǎn)品中臨床療效非常成熟的進(jìn)口補(bǔ)鐵劑，多項(xiàng)研究證明［11］其補(bǔ)鐵療效好，生物利用度高。為了開發(fā)出更多療效好的補(bǔ)鐵劑，研究人員以多種生物作用多樣的大分子多糖為配體，合成各種多糖鐵，目前，對于多糖鐵的制備工藝研究很多，而對于多糖鐵的吸收利用研究則很少。本項(xiàng)目組以含鐵量較高的玉米多糖鐵為研究對象，考察其在大鼠，畢格犬體內(nèi)的藥代動力學(xué)過程，并以力蜚能為對照，考察其在犬體內(nèi)的生物等效性。研究結(jié)果表明，玉米多糖鐵在畢格犬體內(nèi)的藥代動力學(xué)參數(shù)符合二房室模型特征，其末端消除半衰期Tz1/2與劑量呈現(xiàn)正相關(guān)。但 t1/2、tmax和MRT等藥代動力學(xué)參數(shù)隨劑量的增加無明顯變化，其吸收、消除速率為劑量非依賴性。另外，生物利用度研究表明［12］，玉米多糖鐵的相對生物利用度為107.698%，與力蜚能具有生物等效性，是一種在臨床上極具應(yīng)用前景的補(bǔ)鐵劑，可大大改善目前臨床上對進(jìn)口補(bǔ)鐵劑過度依賴的局面。

比較玉米多糖鐵在大鼠和畢格犬體內(nèi)的藥代動力學(xué)參數(shù)發(fā)現(xiàn)，玉米多糖鐵在大鼠和畢格犬中的達(dá)峰時(shí)間差異巨大，大鼠給藥后1～1.5 h時(shí)血藥濃度達(dá)到峰值［13］，而畢格犬在給藥后約4 h血藥濃度才達(dá)到峰值。這表明不同物種的動物對鐵的吸收速度有明顯的差異。而且即使是同種動物，給藥后的峰濃度差異也比較大，可能的原因是鐵的吸收與實(shí)驗(yàn)動物的狀態(tài)有關(guān)。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，玉米多糖鐵在大鼠和畢格犬中吸收和消除速度差異很大，這可能是由種屬差異造成的。研究玉米多糖鐵在不同種屬的藥代動力學(xué)差異可以有助于更加透徹的闡明玉米多糖鐵的藥效學(xué)和毒理學(xué)，并可以為玉米多糖鐵今后的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)參考數(shù)據(jù)。

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