李 佳，楊 芳，鄭洪新△，王擁軍

(1.遼寧中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，沈陽 110847;2.上海中醫(yī)藥大學脊柱病研究所骨代謝疾病研究室，上海 200032)

骨質(zhì)疏松(osteoporosis)是以骨組織顯微結(jié)構(gòu)受損、骨礦成分和骨基質(zhì)等比例不斷減少、骨質(zhì)變薄、骨小梁數(shù)量減低、骨脆性增加的一種全身骨代謝障礙疾病。骨質(zhì)疏松癥不僅會引發(fā)腰背酸痛、乏力、肢體麻木等不適癥狀，更使骨折發(fā)生的幾率增高，降低人們生活質(zhì)量。

本實驗通過檢測骨質(zhì)疏松癥小鼠骨骼、骨骼肌異檸檬酸脫氫酶的變化，以觀察骨骼肌收縮與骨骼協(xié)調(diào)性對骨質(zhì)疏松癥形成的影響，從而闡釋骨質(zhì)疏松癥“骨肉不相親”的病理機制。同時，通過比較和觀察補腎、健脾、活血法干預后對異檸檬酸脫氫酶的效應，探討中醫(yī)防治骨質(zhì)疏松癥的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物、環(huán)境及飼料

8周齡OPG基因敲除小鼠36只(品系C57BL/6J)，由上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院脊柱病研究所引進。另設(shè)正常C57BC小鼠8只作為正常組，普通飼料喂養(yǎng)，體質(zhì)量18～20 g，飼養(yǎng)條件為2級，室溫保持在22～24℃，相對濕度50%。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 異檸檬酸脫氫酶試劑盒由美國ADL公司提供(生產(chǎn)批號為79782)。

1.2.2 儀器 微孔板酶標儀(型號為550，美國伯樂公司)。

1.3 藥物

補腎中藥由淫羊藿、活性馬鹿茸、牡蠣組成;健脾中藥為補中益氣顆粒，由北京漢典制藥有限公司提供(生產(chǎn)批號為090101);對照藥福善美，由杭州默沙東制藥有限公司提供(生產(chǎn)批號為J20080073)。

1.4 造模及給藥

1.4.1 造模 小鼠護骨素(OPG)基因敲除后，喂養(yǎng)6周，經(jīng)雙能X線骨密度儀測小鼠骨密度，確定小鼠造模成功。

1.4.2 分組 除正常組外，將OPG基因敲除小鼠按隨機數(shù)字表法分為模型對照組(模型組)、補腎中藥組(補腎組)、健脾中藥組(健脾組)、活血化瘀中藥組(活血組)和對照藥組(福善美組)5組。

1.4.3 給藥方法 正常組、模型組給予生理鹽水0.5 mL;補腎組、健脾組、福善美組用藥量按成人與小鼠的體質(zhì)量折算系數(shù)9.01折算(成人體質(zhì)量按60 kg計算)，容積為1 mL/100 g體質(zhì)量，補腎組給藥量為鹿茸0.32 g/kg/d，牡蠣0.256 g/kg/d，淫羊藿0.126 g/kg/d;健脾組給藥量0.901 g/kg/d，福善美給藥量1.5016 mg/kg/d。實驗期間，各組小鼠每周稱重1次，并根據(jù)體質(zhì)量變化調(diào)整給藥劑量。

1.5 標本采集及檢測

實驗小鼠最后1次灌胃后，禁食24 h，經(jīng)10%水合氯醛注射麻醉(0.3 mL/100 g體質(zhì)量)后用碘伏消毒手術(shù)部位，剪開腹腔后立即取出大鼠右后肢腓腸肌的白肌部分和左后肢全股骨。將骨骼、骨骼肌分別放入約5倍于組織體積量的MSH緩沖液中清洗、擦干、稱重后，用剪刀剪碎置入勻漿瓶中;以500 rpm勻漿充分，將勻漿后的組織放入離心管中離心2000×g 10 min;提取上清液放入1 mLEP管中。具體檢測步驟按試劑盒說明書進行。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 10.0軟件進行統(tǒng)計分析，選用單因素方差分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，P＜0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 中醫(yī)不同治法對骨保護素基因敲除小鼠骨骼肌中異檸檬酸脫氫酶含量影響比較

表1顯示，骨保護素基因敲除小鼠骨骼肌異檸檬酸脫氫酶檢測結(jié)果顯示，與正常組比較，其他各組小鼠骨骼肌的異檸檬酸脫氫酶顯著降低(P＜0.01);與模型組比較，補腎組、福善美組小鼠骨骼肌的異檸檬酸脫氫酶明顯升高(P＜0.01);健脾組升高程度也比較明顯，但與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義，活血組統(tǒng)計學角度無改變。

2.2 中醫(yī)不同治法對骨保護素基因敲除小鼠骨骼中異檸檬酸脫氫酶含量影響比較

表1 各組小鼠骨骼肌中異檸檬酸脫氫酶含量比較(±s)

表1 各組小鼠骨骼肌中異檸檬酸脫氫酶含量比較(±s)

注:與正常組比較:*P＜0.01;與模空組比較:▲P＜0.01;與補腎組比較:#P＜0.01

組別 小鼠數(shù) 異檸檬酸脫氫酶濃度(mg/L)16.363±1.92模型對照組 8 5.521±0.44*補腎中藥組 7 9.888±1.06＊▲健脾中藥組 7 6.021±0.49*#福 善 美 組 7 12.482±1.31正常組8＊▲

表2顯示，骨保護素基因敲除小鼠骨骼異檸檬酸脫氫酶檢測結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組、補腎組、健脾組和活血組小鼠骨骼的異檸檬酸脫氫酶顯著降低(P＜0.01)，福善美組與正常組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.01);與模型組比較，補腎組、福善美組小鼠骨骼的異檸檬酸脫氫酶明顯升高(P＜0.01);健脾組升高程度也比較明顯，但與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義;活血組統(tǒng)計學角度無改變。

表2 各組小鼠骨骼中異檸檬酸脫氫酶含量的比較(±s)

表2 各組小鼠骨骼中異檸檬酸脫氫酶含量的比較(±s)

注:與正常組比較:*P＜0.01;與模型組比較:▲P＜0.01;與補腎組比較:#P＜0.01

組別 小鼠數(shù) 異檸檬酸脫氫酶濃度(mg/L)16.329±1.01模型對照組 8 5.161±0.28*補腎中藥組 7 9.767±0.74＊▲健脾中藥組 7 5.563±0.38*#福 善 美 組 7 17.321±1.47正常組8＊▲

3 討論

3.1 骨骼與肌肉的失調(diào)性對骨質(zhì)疏松癥影響

骨骼為肌肉提供附著部位，肌肉收縮帶動骨骼完成動作，兩者相互協(xié)同，構(gòu)成骨骼和肌肉系統(tǒng)，實現(xiàn)構(gòu)成形體、支撐質(zhì)量、保護內(nèi)臟、運動等作用。有研究表明，肌肉力量和緊張度變化可作為臨床骨質(zhì)疏松癥形成與否的前瞻指標［1］。中醫(yī)學認為“腎主骨”、“脾主肌肉四肢”，《內(nèi)經(jīng)》中充分論述和強調(diào)腎與骨、脾與肌肉的關(guān)系，可見先天之本(腎)與后天之本(脾)在骨骼、肌肉生理和病理過程中發(fā)揮著決定性影響和作用。而水土兩臟“先天之本”與“后天之本”的相互聯(lián)系，也蘊含和表現(xiàn)在其各自所主的器官(骨骼和肌肉)之間，亦即“骨不濡則肉不能著也，骨肉不相親則肉軟卻”之意。

3.2 異檸檬酸脫氫酶標識的肌肉狀態(tài)與骨質(zhì)疏松癥的關(guān)系

人體肌肉運動的過程伴隨著能量代謝的過程，為獲取肌肉活動所需要的能量，機體任何輕微的活動都可提高代謝率，而獲取肌肉活動所需能量的主要方式即為三羧酸循環(huán)。異檸檬酸脫氫酶是三羧酸循環(huán)過程中重要的調(diào)節(jié)酶之一，在能量代謝和生物合成代謝過程中發(fā)揮著重要作用。其活性在骨骼肌組織中表達越高，說明能量代謝越旺盛［2］。研究表明，異檸檬酸脫氫酶在線粒體中受Ca2+調(diào)節(jié)，亦有研究表明，Mg2+濃度對其受Ca2+影響的敏感性有至關(guān)重要的作用。［3］

3.3 補腎健脾中藥對骨質(zhì)疏松癥的防治作用

骨質(zhì)疏松癥屬于中醫(yī)“骨痿”、“骨痹”范疇，髓道空虛，骨空、骨虛而不堅首當責之于腎，腎精虧虛，不足以榮養(yǎng)骨及骨髓，導致骨質(zhì)疏松。在“腎藏精”、“腎主骨生髓”理論指導下，本研究補腎組用藥選用鄭洪新教授多年科研及臨床實踐總結(jié)的補腎填精中藥復方鹿茸、牡蠣、淫羊藿，通過補腎填精，精足則髓滿，髓實則骨充。腎精源于先天之精，又由后天之精的不斷充養(yǎng)，因此腎精不足亦與后天脾胃化生功能密切相關(guān)。本研究選用補益脾胃的代表方劑補中益氣顆粒，在OPG敲除小鼠體內(nèi)觀察健脾方藥的治療效果。結(jié)果表明，補腎填精中藥和健脾中藥對骨骼及骨骼肌中異檸檬酸脫氫酶的表達都有不同程度的影響，提示先天之精和后天之精共同維持腎中精氣的充盛與否，進而調(diào)節(jié)骨的代謝狀態(tài)，值得臨床治療借鑒和參考。另一方面，“腎主骨”、“脾主肌肉”，通過調(diào)節(jié)骨骼和肌肉的協(xié)調(diào)性，也對臨床治療骨質(zhì)疏松癥有積極的指導意義。

本實驗結(jié)果顯示，骨質(zhì)疏松癥模型小鼠骨骼、骨骼肌的異檸檬酸脫氫酶濃度均與正常組比較顯著降低，說明骨質(zhì)疏松癥形成后，骨骼、骨骼肌功能下降，能量代謝顯著降低。觀察中醫(yī)不同治法對糾正骨質(zhì)疏松癥的影響，補腎方法能顯著提高骨骼、骨骼肌的異檸檬酸脫氫酶濃度，說明補腎法能顯著改善骨質(zhì)疏松癥小鼠骨骼和骨骼肌運動和功能狀態(tài)，維持相對較高水平的能量代謝。健脾組實驗結(jié)果顯示，骨骼、骨骼肌的異檸檬酸脫氫酶濃度有所提高，雖與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義，但可以看出健脾方法有提高骨骼、骨骼肌異檸檬酸脫氫酶濃度的趨勢?；钛M異檸檬酸脫氫酶與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義，對骨質(zhì)疏松小鼠骨骼和骨骼肌功能無改善。本實驗與前期實驗研究結(jié)果一定程度證實，補腎法能夠有效改善和維持骨質(zhì)疏松癥患者骨骼和肌肉的功能，有效防止肌肉萎縮，預防骨折的發(fā)生。臨床應用健脾法可作為補腎法的輔助用藥，以濡養(yǎng)肌肉，促進骨生成，協(xié)助補腎中藥改善預防和治療骨質(zhì)疏松癥。

［1］ToniRikkonen， Joonas Sirola ， KariSalovaara， Marjo Tuppurainen， Jukka S. Jurvelin， Risto Honkanen， Heikki Kr9ger，-Muscle Strength and Body Composition Are Clinical Indicators of Osteoporosis［J］.Calcif Tissue Int，2012，91:131-138.

［2］Korinna Huber，Johanna Petzold，Charlotte Rehfeldt，Klaus Ender，Ilse Fiedler，-Muscle energy metabolism:structural and functional features in different types of porcine striated muscles［J］.J Muscle Res Cell Motil，2007，28:249-258.

［3］G.A.Rutter，R.M.Denton，Rapid purification of pig heart NAD+-isocitrate dehydrogenase-Studies on the regulation of activity by Ca2+，adenine nucleotides，Mg2+and other metal ions［J］.Biochem.J，1989，263(2):445-452.