雷 雪，周俊佟，王雪梅，劉 佳，付殿彬，李麗靜

(長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117)

參附湯是療效確切的中醫(yī)名方，出自明代醫(yī)家薛己《正體類要》，為溫里劑中回陽救逆的代表方劑，由炮附子、人參組成，具有益氣回陽固脫功效，用于陽氣暴脫證、四肢厥逆、冷汗淋漓、呼吸微弱、脈微欲絕［2～4］等。阿霉素(adriamycin，Adr)屬于蒽醌類抗生素，具有抗瘤譜廣、作用強等特點，已在臨床上廣泛用于治療多種惡性腫瘤［1］，但其具有嚴(yán)重的心臟毒性作用。凋亡與自噬廣泛存在于正常細(xì)胞的生理過程中，如清除細(xì)胞廢物、結(jié)構(gòu)重建、生長分化等，又是細(xì)胞對不良環(huán)境的一種防御機制，如對抗?fàn)I養(yǎng)缺乏、電離輻射，同時還參與多種疾病的病理過程，無論是自噬過度還是自噬不足都可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生。細(xì)胞在正常情況下很少會發(fā)生自噬，除非有誘發(fā)因素的存在。本實驗利用阿霉素所致乳鼠心肌細(xì)胞的凋亡及自噬模型，觀察參附湯對凋亡及自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物

注射用鹽酸多柔比星(山西普德藥業(yè)股份有限公司，批號02120603)、參附注射液(雅安三九藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號110306，10 ml/支)、人參(吉林省宏檢大藥房)、附子(吉林省宏檢大藥房)。

1.2 動物

Wistar乳鼠SPF級(吉林大學(xué)動物中心提供，動物合格證SCXK(吉)-2011-0004)。

1.3 試劑

MiniBEST Universal RNA Extraction Kit試劑盒(TaKaRa)，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa)，SYBRPremix Ex Taq試劑盒 (TaKaRa)，DMEM(Hyclone)，胎牛血清(Hyclone)，谷氨酰胺(北京協(xié)和)，雙抗(Genview)，D-Hanks液(北京協(xié)和)，Ⅱ型膠原酶(Sigma)，胰蛋白酶(北京鼎國昌盛)，MTT(Sigma)，CCK-8試劑盒(碧云天)。

1.4 儀器

熒光倒置顯微鏡(奧林巴斯)、CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO)、Bio Rad酶標(biāo)儀(美國伯樂)、熒光定量pcr(美國Stratagene)。

1.5 方法

大鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng):取48 h Wistar乳鼠，75%酒精消毒胸部皮膚，在胸骨左側(cè)約0.4 cm與3、4肋骨間交匯處開胸，擠壓使心臟跳出5～7］。剪掉心尖部分，放入盛有D-Hank’s液的培養(yǎng)皿中。將多余血液排出，剪掉多余組織在D-Hank’s液中沖洗3次。轉(zhuǎn)移至消化管中，使用眼科剪剪碎心臟組織約1 mm3。加入6～8 ml消化液(0.1%Ⅱ型膠原酶+0.25%胰蛋白酶)，使用吸管勻速吹打消化5 min，靜置30 s后棄上清［8］。繼續(xù)加入6 ml消化液，重復(fù)消化5次，取上清液轉(zhuǎn)移至離心管中，加等量的含10%胎牛血清培養(yǎng)液終止消化。1500 r/min，10 min離心，收集各個離心管中的沉淀加入等量的培養(yǎng)液再次離心，收集再次離心后的沉淀加入5 ml培養(yǎng)液吹打均勻，過200目篩網(wǎng)以除去未消化的組織塊，放入培養(yǎng)瓶中，置于CO2培養(yǎng)箱中差速貼壁1.5 h(37℃，5%CO2)。將差速貼壁后的細(xì)胞調(diào)整濃度為5×105分別接種于培養(yǎng)瓶、6孔板、24孔板、96孔板中［9］。將細(xì)胞放于37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)，12 h后伸出偽足，72 h后換液。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞伸出偽足且相互接觸連成片狀并可見搏動［10］。

含藥血清制備:以正常劑量的10倍量，取人參50 g、附子100 g加入10倍量蒸餾水煎煮3次，合并濾液濃縮至50 ml，4℃冰箱保存。使用前充分混勻并加熱至室溫。取10只Wistar大鼠(由吉林大學(xué)動物中心提供)按2 ml/100 g灌胃給藥，另取10只灌胃給予等量蒸餾水作為空白血清，連續(xù)給藥3d后腹主動脈取血，3000 r/min，10 min離心取上清，置于56℃恒溫水浴箱30 min進行滅活處理以消除補體活性后，過 0.22微孔濾膜，保存于 －20℃冰箱［11］。

1.5.1 分組及處理 將培養(yǎng)72 h后的心肌細(xì)胞去除原培養(yǎng)液更換無血清培養(yǎng)液再培養(yǎng)24 h后，按隨機數(shù)字表法分為空白組(10%空白血清DMEM)、陽性對照組(參附注射液 100 μL/ml)、模型組(阿霉素4 μmol)、參附湯組(10%參附湯血清DMEM)4組，先將空白組、陽性對照組、參附湯組給藥后培養(yǎng)12 h，模型組給予無血清培養(yǎng)液，全部棄去培養(yǎng)液，給予阿霉素(4 μmol)造模4 h，監(jiān)測各項指標(biāo)［12］。

1.5.2 監(jiān)測指標(biāo) 細(xì)胞活力檢測:1)MTT比色實驗法:將接種于96孔板的各組經(jīng)上述分組處理后，每孔加入MTT20 μ(5 g/l)與試驗孔平行設(shè)不加細(xì)胞只加相應(yīng)量DMEM的空白對照孔，37℃繼續(xù)孵育4 h終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μLDMSO，震蕩10 min，使甲臜充分溶解。選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔吸光度值(A值)。存活率/%=(實驗組A值－空白對照A值)/(對照組A值－空白對照A值)×100%［13］。2)CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞存活率:將接種于96孔板的各組經(jīng)上述分組處理后，與試驗孔平行設(shè)不加細(xì)胞只加相應(yīng)量DMEM的空白對照孔，每孔加入10 μLCCK-8溶液，37℃繼續(xù)孵育4 h，選擇450 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔吸光度值(A值)。存活率/%=(實驗組A值－空白對照A值)/(對照組A－空白對照A值)×100%［14］。3)RNA的提取和Real Time PCR:①細(xì)胞總RNA的提取:按照TaKaRa公司MiniBEST Universal RNA Extraction Kit試劑盒說明書操作，提取各組細(xì)胞總RNA。cDNA的合成:將抽提的總RNA為模板按照TaKaRa公司Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明書合成 cDNA［15，16］;②引物設(shè)計:采用 primer 510軟件設(shè)計 Becline1引物序列:上游:5’GGCA GTGGCTCCT A TT-3’，下 游:5’-GGCGTGCT GTGCTCTGAAAA-3’;Atg5 引物序列:上游:5’-AGTGGAGGCAACAGAACC-3’，下游:5’-GACACG AA CTGGCAC ATT-3’;Caspase-3引物序列:上游:5-GCTGGACTGCGGTATTG AG-3’，下游:5＇-CCTG GAACATCGGATTTGATT-3’。同時 β-actin作為對照引物序列:上游:5’-CTG TAT GCC TCT GGT CGT AC-3’，下游:5’-TGA TGT CAC GCA TTT CC-3’［17］;③Real Time PCR:按照 TaKaRa 公司 SYBRR Premix Ex Taq試劑盒說明書配制PCR反應(yīng)液20 μL，進行 Real TimePCR 反應(yīng)，95℃ 熱啟動 5 min，95℃ 20 s，58℃ 20 s，72℃ 20 s，40 個循環(huán)。分別擴增同一樣本的目的基因和對照基因，利用其Ct值進行相對定量。即用同組中每個樣本目的基因的Ct值減去對照基因的Ct值(ΔCt)，再用處理組的ΔCt減去對照組的 ΔCt(ΔΔCt)，代入公式 2－ΔΔCt計算，即得到處理組相對對照組PCR產(chǎn)物的濃度比值，以此來反映目的基因mRNA的表達量變化。我們所呈現(xiàn)的實驗結(jié)果是將β-act in作為內(nèi)參照進行的相對定量分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 MTT比色實驗法

與空白組比較，模型組細(xì)胞存活率明顯下降(P＜0.01)，參附湯組及陽性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);與模型組比較，各組心肌細(xì)胞存活率均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或 P＜0.01)。

2.2 CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞存活率

與空白組比較，模型組細(xì)胞存活率明顯下降(P＜0.01)，參附湯組及陽性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);與模型組比較，各組心肌細(xì)胞存活率均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或 P＜0.01)。

表1 4 組細(xì)胞存活率比較(±s，%)

表1 4 組細(xì)胞存活率比較(±s，%)

注:與空白組比較:*P＜0.05，＊＊ P＜0.01;與模型組比較:▲P＜0.05，▲▲P ＜0.01

組別 例數(shù)MTT CCK-8空 白 組5 100±2.459 100±1.744模 型 組 5 65.36±1.705＊＊ 65.44±1.122＊＊陽性對照組 5 88.08±1.098▲▲ 89.98±1.560▲▲參 附 湯 組 5 85.52±1.79▲▲ 87.52±2.070▲▲

2.3 凋亡及自噬相關(guān)基因mRNA的表達

與模型組比較，參附湯組與陽性對照組Caspase mRNA的表達量均明顯下降，參附湯組與陽性對照Beclin1、Atg5 mRNA的表達量均明顯下降。

表2 4組凋亡及自噬相關(guān)基因mRNA的表達

圖1 凋亡及自噬相關(guān)基因mRNA的表達

3 討論

從細(xì)胞水平進行心肌保護研究已成為近年來的熱點，其最大優(yōu)點在于排除在體心臟模型中全身性神經(jīng)因素和體液因素的影響，以及離體心臟不同類型細(xì)胞間的相互作用，因此本實驗采用培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞作為觀察對象。本實驗利用阿霉素具有的心臟毒性致使心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡及自噬，分別采用MTT比色法和CCK-8試劑盒檢測心肌細(xì)胞存活率。與MTT比較，CCK-8具有檢測快速、靈敏度高、重復(fù)性好、使用方便等優(yōu)點。本實驗采用2種方法檢測得到的結(jié)果更為準(zhǔn)確，其檢測結(jié)果可以看出，參附湯組細(xì)胞存活率較高，說明參附湯對阿霉素所致的襲擊細(xì)胞損傷有一定的抑制作用。采用Real Time PCR檢測凋亡相關(guān)基因caspase和自噬相關(guān)基因Beclin1、Atg5的表達水平，從實驗結(jié)果中可以看出參附湯對凋亡和自噬有抑制作用。課題組研究表明，參附湯血中移行成分可保護缺氧復(fù)氧的心肌細(xì)胞，具有抑制細(xì)胞凋亡和自噬作用;參附湯及其血中移行成分對大鼠急性心衰具有一定的治療作用，并能調(diào)整心臟的能量代謝［18，19］。

［1］潘躍銀，徐淑萍，魏偉.尼美舒利與阿霉素聯(lián)合應(yīng)用對肝癌HepG2細(xì)胞增殖及凋亡的影響［J］.中國藥理學(xué)通報，2006，22(7):884-7.

［2］戴世學(xué)，劉強，鄭學(xué)寶.參附湯治療心衰的藥理機制及臨床應(yīng)用［J］.陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2006，29(5):56-57.

［3］孫亞武，陸曙.參附湯在急性心肌梗死合并心原性休克中的治療作用［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2006，5(34):66-67.

［4］沈燕，吳立軍，王本祥.參附湯體內(nèi)代謝化學(xué)成分的初步研究［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2001，18(1):23-26.

［5］黃勤歡，黃瑾.人外周血T淋巴細(xì)胞自噬現(xiàn)象的觀察［J］.中國免疫學(xué)雜志，2007，23(6):500-503.

［6］何偉，張明雪，閆麗娟.乳鼠原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)概要［J］.實用心腦肺血管病雜志，2009，17:339-40.

［7］楊瑞豐，潘偉.心肌細(xì)胞培養(yǎng)進展［J］.中國心血管病研究雜志，2005，3:634-636.

［8］王瑞華，蘭曉莉，曹國祥，等.新生sd大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)方法的簡化及改良［J］.心臟雜志，2008，20:154-7.

［9］Kalyanaraman B，Joseph J，Kalivendi S，et a.l Doxorubicin-Induced apotosis: implications in cardiotoxicity［J］.Mol CellBiochem，2002，234-235(122):119-124.

［10］Cohn GM.Caspase:the executioners of apoptosis［J］.Biochem J，1997，326(Pt1):1-16.

［11］WangL，MaW，Markovich R，et a.l Regulation of cardiomyocyte apoptotic signaling by insulin-like growth factor I［J］.Circ Res，1998，83(5):516-522.

［12］文柳靜.多柔比星心臟毒性的研究［J］.中國藥師，2006，9(10):956-958.

［13］王贊宏.自噬與腫瘤［J］.國外醫(yī)學(xué)·婦產(chǎn)科學(xué)分冊，2007，34(6):401-404.

［14］葉青.自噬的分子機制與病理生理意［J］.國際病理科學(xué)與臨床雜志，2007，27(8):358 －362.

［15］Shin IW，Jang IS，Lee SH，Baik JS，Park KE，Sohn JT，et al.Propofol has delayed myocardial protective effects after a regional ischemia/reperfusion injury in an in vivo rat heart model［J］.Korean JAnesthesiol，2010，58:378-382.

［16］Mizushima N.Methods for monitoring autophagy［J］.Int J Biochem Cell Biol，2004，36(12):2491-2502.

［17］Seglen PO，Gordon PB.3-Methyladenine:specific inhibitor of autophagic/lysosomal protein degradation in isolated rat hepatocytes［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1982，79(6):1889-1892.

［18］李麗靜，劉佳，李玉梅，等.參附湯血中移行成分對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡和自噬的影響［J］.中醫(yī)藥臨床，2012，56(4):773-775.

［19］李麗靜，李秋明，王晶華，等.參附湯血中移行成分對心源性休克大鼠血流動力學(xué)及能量代謝的影響［J］.中藥藥理與臨床，2010，28(3):19-21.