王 巍 曲 穎 賈維剛△ 王加志

（1.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江省醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154000）

急性腦缺血屬中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇，源于《內(nèi)經(jīng)》對(duì)中風(fēng)病因病機(jī)的認(rèn)識(shí)。中醫(yī)藥在防治缺血性中風(fēng)急性期方面具有一定優(yōu)勢(shì)，一定程度上提高了急性缺血性中風(fēng)的臨床療效。近年來研究表明，腦缺血-再灌注過程中產(chǎn)生大量氧自由基，致使神經(jīng)細(xì)胞功能受到嚴(yán)重影響；同時(shí)，腦缺血再灌注時(shí)繼發(fā)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)繼發(fā)性腦損害，是導(dǎo)致腦組織損傷的重要途徑［1-2］。本研究通過建立大鼠腦缺血再灌注損傷動(dòng)物模型，觀察腦毒清顆粒對(duì)大鼠神經(jīng)功能損傷情況的影響，以及血清中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）含量的變化，探討腦毒清顆粒治療腦缺血再灌注損傷的作用機(jī)制，為指導(dǎo)其在臨床的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康雄性SD大鼠80只（SPF級(jí)），體質(zhì)量（300±20）g，由黑龍江省哈爾濱市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)2011007018。

1.2 試藥與儀器 腦毒清顆粒（由黑龍江省中醫(yī)研究院藥劑室提供）；SOD、MDA檢測(cè)試劑盒 （南京建成生物工程研究所）；大鼠hs-CRP ELISA試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）。電子分析天平TG SA（上海微光儀器廠）；臺(tái)式離心機(jī)TDL-60B（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；紫外可見光光度計(jì)尤尼柯UV-2102PCS（上海第二分析儀器廠）；數(shù)顯式電熱恒溫箱 （上海躍進(jìn)儀器廠）；MultiskanMK3型酶標(biāo)儀（芬蘭Thermo Labsys-tems公司）。

1.3 分組與給藥 將大鼠隨機(jī)分為4組，即對(duì)照組10只，假手術(shù)組10只，模型組和腦毒清組各30只，模型組和腦毒清組按灌注時(shí)間分為12、24、48 h 3個(gè)亞組，每組10只。腦毒清組按60 mg/kg灌胃腦毒清顆粒，模型組和假手術(shù)組給予等量生理鹽水。連續(xù)給藥7 d，末次給藥30min后，對(duì)大鼠進(jìn)行右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞模型手術(shù)。

1.4 模型制備 參照文獻(xiàn)［3］采用改良的線栓法復(fù)制大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注損傷模型。

1.5 觀察指標(biāo) （1）神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分大鼠。在缺血2 h后立即進(jìn)行再灌注，再灌注30min后即刻進(jìn)行神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分。參照Longa 5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［4］。評(píng)分為1～3分者納入實(shí)驗(yàn)組，未達(dá)標(biāo)準(zhǔn)者排除。假手術(shù)組、模型組和腦毒清組，分別于12、24、48 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察實(shí)驗(yàn)指標(biāo)。（2）SOD、MDA和hs-CRP含量測(cè)定。假手術(shù)組于麻醉前及假手術(shù)后12 h眼窩取血。模型組及腦毒清組于MCAO前眼窩取血，術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)斷頭取血。離心分離血清備用。采用比色法測(cè)定大鼠血清SOD、MDA含量，采用ELISA方法檢測(cè)大鼠血清hs-CRP含量，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料以（）表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 腦毒清顆粒對(duì)大鼠神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分的影響 見表1。結(jié)果示缺血再灌注術(shù)后，模型組動(dòng)物表現(xiàn)出明顯神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能障礙，而腦毒清組大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀有不同程度改善（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 各組缺血再灌注術(shù)后神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分（分，）

表1 各組缺血再灌注術(shù)后神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分（分，）

與模型組同時(shí)期比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

2.2 腦毒清顆粒對(duì)大鼠血清SOD含量的影響 見表2。模型組大鼠血清中SOD含量明顯低于假手術(shù)組；腦毒清組大鼠血清中SOD含量明顯高于模型組，均有明顯差異（P＜0.01）。

表2 各組大鼠血清SOD含量比較（U/mL，）

表2 各組大鼠血清SOD含量比較（U/mL，）

2.3 腦毒清顆粒對(duì)大鼠血清中MDA含量的影響 見表3。表3顯示模型組大鼠血清中MDA含量明顯高于假手術(shù)組；腦毒清組含量低于模型組，有顯著差異（P＜0.01）。

表3 各組大鼠血清MDA含量比較（nmol/mL，）

表3 各組大鼠血清MDA含量比較（nmol/mL，）

2.4 腦毒清顆粒對(duì)大鼠血清hs-CRP含量的影響 見表4。表4顯示，腦毒清組分別與模型組在術(shù)前及術(shù)后12、24、48 h 比較，均有顯著差異（P＜0.01）。

表4 各組大鼠血清hs-CRP含量比較（mg/L，）

表4 各組大鼠血清hs-CRP含量比較（mg/L，）

3 討 論

腦缺血-再灌注過程中產(chǎn)生的大量氧自由基通過氧化反應(yīng)造成細(xì)胞膜磷脂分子中的不飽和脂肪酸過氧化，最終產(chǎn)生多量的脂質(zhì)過氧化物，脂質(zhì)過氧化物經(jīng)過氧化酶催化生成MDA，最終使磷脂結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，細(xì)胞膜受到嚴(yán)重?fù)p傷，致使神經(jīng)細(xì)胞功能受到嚴(yán)重影響，加重腦水腫［1］。正常機(jī)體內(nèi)存在抗氧化系統(tǒng)，如超氧化物歧化酶等抗氧化酶，該系統(tǒng)可相互協(xié)調(diào)清除自由基，減少脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，使人體內(nèi)自由基的生成和清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。但在缺血再灌注損傷條件下，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生大量的自由基，使脂質(zhì)過氧化物生成與清除平衡被打破，引起組織的損傷［5-6］。MDA是脂質(zhì)代謝產(chǎn)物，MDA含量多少可以間接反映出腦組織中氧自由基含量的變化以及氧自由基引起脂質(zhì)過氧化程度，從而判斷腦細(xì)胞損傷程度；SOD是機(jī)體清除氧自由基的主要酶類，其活性高低可以間接反映腦組織清除氧自由基的能力。

研究表明，hs-CRP不僅是炎癥的標(biāo)記物，也是炎癥的重要參與者［7-8］，其可與脂蛋白結(jié)合，由經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體系統(tǒng)，介導(dǎo)腦缺血/再灌注損傷的級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，造成血管內(nèi)膜損傷。局部腦缺血后，升高的hs-CRP直接導(dǎo)致炎性介質(zhì)白細(xì)胞介素（IL-1、IL-6）和自由基的大量釋放，引起血管痙攣，導(dǎo)致半暗帶區(qū)域組織缺血、缺氧。同時(shí)受損的內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，激活了一定的細(xì)胞因子（如 TNF-α、IL-1、IL-6 等），促使腦血管缺血程度增加。另外，hs-CRP可與粒細(xì)胞、單核細(xì)胞的CRP受體結(jié)合，使之浸潤(rùn)、聚積，產(chǎn)生細(xì)胞因子，造成血管損傷。另一方面，hs-CRP升高促使血管內(nèi)皮細(xì)胞間黏附分子-1、C-選擇素等黏附分子的表達(dá)，促進(jìn)了巨噬細(xì)胞等炎癥性細(xì)胞進(jìn)入血管內(nèi)皮，造成炎癥損傷。此外，hs-CRP還有免疫調(diào)節(jié)活性：其分解產(chǎn)生的多肽具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)活性，能夠促進(jìn)局部免疫調(diào)節(jié)障礙，加重神經(jīng)損傷的程度。因此，hs-CRP不但是預(yù)測(cè)中風(fēng)病發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素和評(píng)估病情及預(yù)后的最敏感指標(biāo)［8］，并且在導(dǎo)致缺血性腦損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)的炎癥機(jī)制中起著關(guān)鍵的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，各時(shí)間點(diǎn)模型組大鼠在腦缺血再灌注損傷后，出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺損癥狀，同時(shí)大鼠血清中SOD含量較正常組明顯降低，MDA含量較正常組明顯升高，hs-CRP含量較正常組明顯升高；經(jīng)腦毒清顆粒治療后各時(shí)間點(diǎn)大鼠神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分下降，說明腦毒清顆粒能夠減輕腦缺血再灌注損傷，此時(shí)該組各時(shí)間點(diǎn)大鼠血清中SOD含量較模型組升高，MDA含量較模型組降低，hs-CRP含量較模型組降低。說明腦毒清顆粒能通過調(diào)節(jié)人體自由基的生成和清除的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，降低炎癥標(biāo)記物的含量，達(dá)到保護(hù)腦組織的目的。同時(shí)，筆者發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，治療組血清hs-CRP在早期（12 h）升高之后則持續(xù)下降趨勢(shì)。腦毒清顆粒減輕再灌注損傷的作用是通過降低hs-CRP的炎癥水平、消減炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的啟動(dòng)因素來實(shí)現(xiàn)的。本研究結(jié)果表明，腦毒清顆粒在防治腦腦缺血再灌注損傷過程中有良好的保護(hù)作用，能夠通過降低hs-CRP的啟動(dòng)、調(diào)節(jié)和清除自由基進(jìn)而減少神經(jīng)功能的缺損程度。

［1］Schmidley JW.Freeradicalsin central nervous system［J］.Ischemia Stroke，1990，21（7）：1086.

［2］羅梅，賀巖.復(fù)發(fā)性腦梗死患者高敏C-反應(yīng)蛋白變化及相關(guān)因素分析［J］.國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2010，31（5）：506.

［3］馬賢德，孫宏偉.線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型的方法研究［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2009，27（6）：1200-1201.

［4］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in rats［J］.Stroke，1989，20（1）：84-91.

［5］印大中.衰老奧秘研究最新進(jìn)展：自由基氧化-非酶糖基化衰老學(xué)說［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2005，14（1）：7.

［6］Takayasu Y，Nakaki J，Kawasaki T，et al.Edaravone，a radical scavenger，inhibits mitochondrial permeability transition pore in rat brain［J］.Pharmacol Sci，2007，103：434-437.

［7］Di Napoli M，Di Gianfilippo G，Sollecito A，et al.C-reactive protein and outcome after first-ever ischemic stroke ［J］.Stroke，2000，31：238-239.

［8］Elkind MS，Tai W，Coates K，et al.High-sensitivity C-reactive protein， lipoprotein-associated phospholipids A2， and outcome after ischemic stroke［J］.Arch Intern Med，2006，166（19）：2073.