李超，祖勉，連雯雯，劉艾林，2，3，杜冠華，2，3

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥物研究所；2.天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.藥物靶點(diǎn)研究與新藥篩選北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；北京 100050

Cdc2-like kinase 1（CLK1）是一種具有雙特異性的絲/蘇氨酸和酪氨酸蛋白激酶，是CLK 激酶家族成員，主要與真核生物中mRNA 的選擇性剪接相關(guān)[1]。選擇性剪接是指經(jīng)過單一的基因可產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和功能相異的多種蛋白亞型[2]。近年來全基因序列分析結(jié)果顯示，選擇性剪接使得有限數(shù)量的基因可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)水平的高度多樣性[3]?；蚪M分析結(jié)果顯示，約35%～60%的人類基因可編碼至少2種選擇性剪接的蛋白亞型。對(duì)剪接位點(diǎn)進(jìn)行選擇性調(diào)控，為基因表達(dá)調(diào)控和蛋白質(zhì)組多樣性的產(chǎn)生提供了廣泛的機(jī)制，這種調(diào)控方式也在眾多生理過程中發(fā)揮重要作用，例如胚胎發(fā)育、細(xì)胞生長和凋亡。CLK1 的效應(yīng)蛋白SR 家族是構(gòu)成前體mRNA 組成性剪接的必要成員，同時(shí)在選擇性剪接中也發(fā)揮了重要作用[4]。

CLK1通過磷酸化SR 蛋白進(jìn)而影響剪接位點(diǎn)的選擇。哺乳動(dòng)物的CLK蛋白家族包括一個(gè)SR區(qū)域，能夠在體外磷酸化SR 蛋白，在體內(nèi)磷酸化SF2/ASF（splicing factor 2/alternative splicing factor）。CLK在體外過表達(dá)體系中其酪氨酸、絲氨酸和蘇氨酸可發(fā)生自磷酸化，表明CLK 家族屬于雙特異性蛋白激酶家族。

CLK1 與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。我們構(gòu)建了CLK1基因真核細(xì)胞過表達(dá)載體，鑒定了重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后CLK1蛋白的表達(dá)，并對(duì)其活性進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證，旨在建立CLK1在真核細(xì)胞中過表達(dá)模型，為研究CLK1在生理病理狀態(tài)下的作用及藥物發(fā)現(xiàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

HEK293A 細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室凍存，用于轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒，生長于含10%胎牛血清的α-MEM 培養(yǎng)基中；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans 10購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；真核表達(dá)載體pEGFP-N2（圖1）由本實(shí)驗(yàn)室以質(zhì)粒形式凍存于-40℃。

高保真DNA 聚合酶KOD-Plus 購于Toyobo 公司；內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ、T4DNA 連接酶、膠回收試劑盒MiniBESTAgarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0 均購于TaKaRa 公司；逆轉(zhuǎn)錄酶TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；蛋白marker 購于Fermentas公司；高純度質(zhì)粒小提試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒均購于天根生物技術(shù)有限公司；CLK1抗體購自NOVUS BIOLOGICALS 公司；轉(zhuǎn)染試劑LipofectAMINE2000購于Invitrogen公司。

Spectra Max M5 酶標(biāo)儀（Molecular Devices）；CFX96熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀、蛋白電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀、Molecular Imager ChemiDoc XRS+Systerm（Bio-Rad）；Allegra X-22R Centrifuge（Beckman）。

1.2 人CLK1基因序列分析及引物設(shè)計(jì)

在GenBank 中檢索人CLK1 mRNA 序列（NM_004071.3）中的CDS 區(qū)（182～1636），經(jīng)Vector NTI軟件分析，該序列不含BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)。

用Vector NTI 軟件設(shè)計(jì)引物pEGFP-hCLK1-STTAGAATTCATGAGACACTCAAAGAGAACTTACT、pEGFP-hCLK1-A-ATTTGGATCCGTATACTTTTCT TCAGAAGGTC，由奧科鼎盛公司合成。

1.3 人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）總RNA 提取、cDNA合成及CLK1基因的制備

1.3.1 HUVEC 細(xì)胞總RNA 提取與第一鏈cDNA 合成 取一瓶生長狀態(tài)良好的HUVEC，用TRIzol 試劑常規(guī)提取總RNA，溶于20μL DEPC 水中，以HUVEC 的總RNA 為模板，用cDNA 第一鏈合成試劑盒（TransScript First-Strand cDNA Synthesis Super-Mix）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系包括總RNA（50 ng～5μg）1μL、AnchoredOligo（dT）181μL、2×TS reaction mix 10μL、Transcript RT/RI Enzyme mix 1μL、無RNA 的水6μL。將以上組分混勻后置于PCR 儀中，42℃孵育30 min，85℃加熱5 min 失活TransScript RT。1.3.2 PCR 擴(kuò)增CLK1 基因序列 PCR 擴(kuò)增條件為94℃2 min、94℃15 s、55℃30 s、68℃2 min，循環(huán)35 次，CLK1 基因片段長度為1455 bp，用1%瓊脂糖凝膠電泳及膠回收試劑盒純化PCR 產(chǎn)物，為下一步雙酶切反應(yīng)做準(zhǔn)備。

圖1 pEGFP-N2空載體及其部分基因序列和多克隆位點(diǎn)

1.4 CLK1/pEGFP-N2重組表達(dá)載體構(gòu)建

將CLK1 基因PCR 產(chǎn)物及pEGFP-N2 載體分別用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，膠回收分別純化雙酶切產(chǎn)物，用T4DNA 連接酶于16℃連接16 h，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌Trans 10 細(xì)胞，以含卡那霉素的LB選擇性固體培養(yǎng)基37℃過夜培養(yǎng)，挑取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，用高純度質(zhì)粒小提試劑盒提取菌體質(zhì)粒，對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定后測(cè)序。

1.5 提取無內(nèi)毒素重組載體

將酶切陽性且測(cè)序結(jié)果吻合的菌液接種于含100μg/mL 卡那霉素的LB 培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，收集菌液，用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒，按照說明書抽提無內(nèi)毒素重組質(zhì)粒。

1.6 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞

收獲處于對(duì)數(shù)生長期的HEK293A 細(xì)胞，以2×104/孔接種于6 孔培養(yǎng)板中，在37℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)24 h至細(xì)胞長至80%～90%融合，按照質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑為1μg∶3μL的比例進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞分為陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染pEGFP-N2 空載體）和實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染CLK1/pEGFP-N2 重組質(zhì)粒）。轉(zhuǎn)染24、48、72 h后收集蛋白進(jìn)行表達(dá)水平的檢測(cè)。

1.7 CLK1蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

1.7.1 Western 印跡 將重組質(zhì)粒CLK1/pEGFP-N2和對(duì)照質(zhì)粒pEGFP-N2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞后于不同時(shí)刻收集的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE，將PAGE 膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，用5%胎牛血清（BSA）室溫下將膜封閉2 h，用一抗及二抗分別于4℃雜交過夜和室溫雜交2 h，在膜表面加適量底物發(fā)光液，在ECL 凝膠成像儀中曝光。通過考察不同轉(zhuǎn)染時(shí)間對(duì)目的蛋白表達(dá)的影響，找到CLK1 蛋白在HEK293A 細(xì)胞中大量表達(dá)的轉(zhuǎn)染時(shí)間。

圖2 PCR擴(kuò)增CLK1基因瓊脂糖電泳

1.7.2 免疫熒光 重組質(zhì)粒CLK1/pEGFP-N2和對(duì)照質(zhì)粒pEGFP-N2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞后24、48、72 h，吸除細(xì)胞上清，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，以0.3% Triton X-100 透化細(xì)胞，以5%無菌BSA 于4℃封閉2 h，把抗CLK1 的兔單克隆抗體（用5% BSA 稀釋至1/100）加至細(xì)胞，4℃雜交過夜，用PBS 洗掉非特異性結(jié)合的一抗，把熒光二抗Anti-RabbitIgG（Alexa Fluor 488 Conjugate）用1%無菌BSA 稀釋至1/1000，加至細(xì)胞，25℃孵育2 h，用DAPI 染細(xì)胞核，以PBS 洗掉非特異性結(jié)合的熒光二抗，最后在高內(nèi)涵細(xì)胞成像系統(tǒng)中進(jìn)行細(xì)胞核定位和Target 蛋白成像，考察不同時(shí)間內(nèi)蛋白的表達(dá)水平。

1.8 磷酸化SF2/ASF蛋白的表達(dá)水平檢測(cè)

重組質(zhì)粒CLK1/pEGFP-N2和對(duì)照質(zhì)粒pEGFPN2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞后24 h 收集蛋白樣品進(jìn)行Western 印跡，雜交SF2/ASF 磷酸化抗體，檢測(cè)過表達(dá)后CLK1蛋白激酶的活性。

2 結(jié)果

2.1 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳

1%瓊脂糖電泳結(jié)果顯示，PCR 反應(yīng)產(chǎn)物在1000～2000 bp 間有特異性條帶，與CLK1 基因理論值1455 bp相符（圖2）。

2.2 CLK1/pEGFP-N2重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

根據(jù)CLK1和pEGFP-N2的濃度，計(jì)算二者在連接體系中的加入體積，使得目的基因CLK1的摩爾濃度與載體pEGFP-N2的摩爾濃度之比為10∶1。取適量連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)擴(kuò)增，在固體培養(yǎng)基上挑取4 個(gè)單克隆，提取CLK1/pEGFP-N2 重組質(zhì)粒，用BamHⅠ和EcoRⅠ對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，電泳結(jié)果如圖3，重組質(zhì)粒酶切后產(chǎn)生4700與1500 bp條帶，分別與pEGFP-N2和CLK1 基因大小相符，初步確定CLK1/pEGFP-N2重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 CLK1/pEGFP-N2重組質(zhì)粒的測(cè)序分析

提取CLK1/pEGFP-N2重組質(zhì)粒，經(jīng)奧科鼎盛生物公司測(cè)序，結(jié)果與GenBank 中的序列完全一致，無移碼，無突變，確定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖3 真核重組表達(dá)載體CLK1/pEGFP-N2的雙酶切鑒定

2.4 Western 印跡檢測(cè)CLK1 在HEK293A 細(xì)胞中的過表達(dá)

HEK293A 細(xì)胞轉(zhuǎn)染CLK1/pEGFP-N2 后，于24、48、72 h 收集細(xì)胞總蛋白，Western 印跡檢測(cè)細(xì)胞中CLK1 的表達(dá)情況，以轉(zhuǎn)染pEGFP-N2 組為陰性對(duì)照，未加轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒的HEK293A 細(xì)胞作為另一陰性對(duì)照。結(jié)果如圖4，HEK293A 細(xì)胞自身的CLK1表達(dá)量較高，CLK1/pEGFP-N2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞后24、48、72 h，在相對(duì)分子質(zhì)量82×103附近出現(xiàn)與GFP 標(biāo)簽蛋白融合表達(dá)的CLK1蛋白，隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長蛋白表達(dá)量下降，轉(zhuǎn)染24 h 后CLK1 的表達(dá)量最高。因此，選擇轉(zhuǎn)染后24 h 作為CLK1 在HEK293A 細(xì)胞中過表達(dá)的最佳時(shí)間。

2.5 免疫熒光檢測(cè)CLK1 在HEK293A 細(xì)胞中的過表達(dá)

用細(xì)胞免疫熒光方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)CLK1過表達(dá)，結(jié)果如圖5。轉(zhuǎn)染24 h后CLK1熒光強(qiáng)度顯著增加，說明CLK1在24 h時(shí)表達(dá)量最高。

圖4 Western印跡檢測(cè)HEK293A細(xì)胞轉(zhuǎn)染CLK1/pEGFP-N2后CLK1的過表達(dá)

圖5 熒光顯微鏡觀察HEK293A細(xì)胞轉(zhuǎn)染CLK1/pEGFP-N2后CLK1的過表達(dá)

2.6 磷酸化SF2/ASF蛋白的表達(dá)水平

Western 印跡結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染了空白質(zhì)粒的對(duì)照組相比，CLK1 過表達(dá)組SF2/ASF 蛋白的磷酸化水平顯著提高，說明過表達(dá)的CLK1 具有良好的活性。見圖6。

圖6 Western印跡檢測(cè)過表達(dá)24 h后細(xì)胞中SF2/ASF蛋白的磷酸化水平

3 討論

人蛋白激酶有500 多種，負(fù)責(zé)磷酸化底物蛋白的絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的各種信號(hào)傳導(dǎo)過程[5]。蛋白激酶活性異常已被證明與多種疾病相關(guān)，如癌癥、免疫系統(tǒng)疾病、神經(jīng)退行性疾病、炎癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化和感染性疾病等[6]。因此，蛋白激酶的研究對(duì)我們認(rèn)識(shí)疾病的作用機(jī)制及合理地開發(fā)藥物具有一定的指導(dǎo)意義。CLK1 是廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的一種蛋白激酶，可以選擇性地磷酸化SR 家族蛋白，從而調(diào)控基因的選擇性剪接。目前已知CLK1參與多種疾病的發(fā)生與發(fā)展，而對(duì)CLK1的研究主要集中在其通過激活下游的信號(hào)通路，從而調(diào)節(jié)特異性剪接過程。CLK1 在人免疫缺陷病毒（HIV）的基因表達(dá)中發(fā)揮重要作用[7]，同時(shí)可以影響流感病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制[8]。CLK1 也參與了神經(jīng)發(fā)育過程，其在PC12 細(xì)胞中的表達(dá)可以影響神經(jīng)元的分化[9]。CLK1 可以調(diào)節(jié)人前體脂肪細(xì)胞3T3-L1 的選擇性剪接及脂肪的生成[10]；在低氧損傷的人肺癌細(xì)胞缺氧模型中，CLK1可以調(diào)控組織增生因子的表達(dá)[11]。

我們建立了從CLK1 基因片段的合成到真核表達(dá)載體CLK1/pEGFP-N2 的構(gòu)建及其在真核細(xì)胞HEK293A 中過表達(dá)的技術(shù)方法，該方法未見文獻(xiàn)報(bào)道。pEGFP-N2 載體表達(dá)穩(wěn)定且拷貝數(shù)較高，并且其與目的基因融合表達(dá)的GFP可在熒光顯微鏡下直接檢測(cè)。通過Western 印跡與免疫熒光共同驗(yàn)證了CLK1 在不同轉(zhuǎn)染時(shí)間的過表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后24 h 時(shí)CLK1 的表達(dá)量最高，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其下游的磷酸化SF2/ASF 蛋白含量顯著上升，說明過表達(dá)的CLK1 活性較高。CLK1 真核細(xì)胞過表達(dá)模型的建立，有助于對(duì)其生物學(xué)功能及其在生理及病理過程中作用的研究，為新藥研發(fā)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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