王成紅 ，于傳亭，張奇舒，李鵬飛，王曉丹，修冰水，張賀秋

1.煙臺(tái)市煙臺(tái)山醫(yī)院 檢驗(yàn)科，山東 煙臺(tái) 264000；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850

肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，Mp）是兒童和青少年非典型肺炎的首要病原微生物[1]，由其引起的臨床癥狀同其他病原體相似，但臨床用藥并不相同[2]，因此，研制靈敏、特異、便捷的快速早期診斷試劑，對(duì)于Mp感染的診斷和治療意義重大[3]。

肺炎支原體M129 株的全基因測(cè)序工作于1996年完成。M129 基因組全長(zhǎng)816 kb，編碼超過(guò)400 個(gè)功能蛋白[4]。其中P30 蛋白是錨定于Mp 細(xì)胞膜上的重要黏附蛋白，包含275 個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子質(zhì)量約為29.7×103，其基因序列全長(zhǎng)825 bp。研究顯示P30 蛋白可以激起宿主的免疫反應(yīng)[5]，是除了黏附蛋白P1 外的另一個(gè)重要的黏附素和免疫原。由于Mp采用的是偏性密碼子，其野生基因不適合在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。為此，我們利用生物信息學(xué)方法和密碼子優(yōu)化技術(shù)設(shè)計(jì)并獲得優(yōu)化的Mp 黏附蛋白P30基因序列，實(shí)現(xiàn)了其在大腸桿菌中的高效表達(dá)。

1 材料和方法

1.1 材料

Mp 患者血清樣本來(lái)自煙臺(tái)山醫(yī)院小兒科住院病人，正常人血清樣本來(lái)自煙臺(tái)山醫(yī)院體檢中心。

TaqDNA 聚合酶為北京百泰克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；T4DNA 連接酶為TaKaRa 公司產(chǎn)品；DNA限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和XbaⅠ購(gòu)自Promega 公司；PCR 產(chǎn)物回收試劑盒由北京百泰克生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成；DNA序列測(cè)定由中美泰和生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 判定標(biāo)準(zhǔn)

樣品與未致敏粒子（最終稀釋率1∶20）的反應(yīng)圖像判定為（-），而與致敏粒子（最終稀釋率1∶80）的反應(yīng)圖像判定為（+），則結(jié)果判定為陽(yáng)性。將顯示反應(yīng)圖像為（+）時(shí)的最終稀釋率作為抗體滴度。

1.3 抗原表位分析

從NCBI 網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/proteins/）下載P30 黏附蛋白的氨基酸序列和核苷酸序列，采用Biosun 生物軟件比對(duì)序列，分析P30 的抗原表位情況，確定克隆表達(dá)的優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)間。

1.4 肺炎支原體P30黏附蛋白基因的密碼子優(yōu)化與基因合成

采用Genscript 軟件在線分析P30 基因的密碼子表達(dá)情況；采用自編軟件，根據(jù)P30 優(yōu)勢(shì)抗原表位的氨基酸序列，設(shè)計(jì)并優(yōu)化由大腸桿菌優(yōu)勢(shì)密碼子組成的P30 基因，分段設(shè)計(jì)并合成引物，采用退火PCR方法合成各基因片段，利用基因片段末端重復(fù)序列將各片段搭橋擴(kuò)增，最終得到完整的P30優(yōu)化基因。

1.5 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

利用分別含XhoⅠ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)的上游引物P30F-XhoⅠ（GCCTCGAGGCCCTCATTGTTC）、下游引物P30R-XbaⅠ（GCTCTAGATTAACGCTTCGG T）對(duì)上述基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，從而在基因片段兩端引入酶切位點(diǎn)，經(jīng)雙酶切回收后插入同樣經(jīng)XhoⅠ、XbaⅠ酶切的原核表達(dá)載體pBVIL1-His，轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101，挑選陽(yáng)性克隆，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜后42℃誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE鑒定，對(duì)高表達(dá)菌株測(cè)序。

1.6 抗原表達(dá)與純化

鑒定出的陽(yáng)性克隆于37℃培養(yǎng)過(guò)夜后轉(zhuǎn)至新鮮的LB 培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)2～3 h，至D600nm值為0.4～0.6，42℃水浴誘導(dǎo)表達(dá)5 h，離心收集菌體，用TE 緩沖液沖洗菌體并懸起，超聲波破碎細(xì)胞，離心收集上清，用Ni 柱分離純化融合蛋白IL1-P30，收集洗脫峰，SDS-PAGE鑒定各步分離產(chǎn)物。

1.7 間接ELISA法評(píng)價(jià)IL1-P30融合蛋白的抗原性

以純化的IL1-P30 融合蛋白包被酶聯(lián)板，用間接ELISA 法對(duì)肺炎患者和正常人血清樣本進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)D450nm值計(jì)算S/c，評(píng)價(jià)重組抗原的反應(yīng)活性。

2 結(jié)果

2.1 肺炎支原體P30黏附蛋白的表位分析

運(yùn)用Biosun 生物軟件分析比對(duì)肺炎支原體P30黏附蛋白的氨基酸序列（GenBank：M57245.1），結(jié)果顯示，除75～95 aa區(qū)段抗原性較弱外，整個(gè)P30蛋白具有較強(qiáng)的抗原性（圖1）。

2.2 肺炎支原體P30黏附蛋白基因的密碼子優(yōu)化和獲取

野生型P30 基因全長(zhǎng)825 bp，由275 個(gè)密碼子編碼相應(yīng)的氨基酸序列。采用Genscript軟件對(duì)野生Mp基因進(jìn)行密碼子分析顯示，約13%的密碼子表達(dá)效率低于30%，屬于稀有密碼子，密碼子適應(yīng)指數(shù)（CAI）為0.59（圖2A），屬于Genscript 軟件中定義的難于表達(dá)的基因。采用自編程序?qū)30 密碼子基因優(yōu)化后，稀有密碼子比率僅為3%，CAI 提高到0.84，屬于Genscript軟件中定義的易表達(dá)基因（圖2B）。

采用重疊延伸PCR 方法分4 段分別擴(kuò)增基因片段，而后相鄰片段末端搭橋退火延伸，最終獲得全長(zhǎng)825 bp 的目的基因，測(cè)序結(jié)果顯示獲得的基因序列正確。

圖1 肺炎支原體P30黏附蛋白氨基酸序列抗原表位預(yù)測(cè)

圖2 P30基因密碼子分析

2.3 抗原表達(dá)與純化

大量誘導(dǎo)表達(dá)測(cè)序正確的表達(dá)菌株，超聲波破碎后SDS-PAGE鑒定，IL1-P30融合蛋白為包涵體表達(dá)，相對(duì)分子質(zhì)量為43.5×103，與預(yù)期相符（圖3）。

2.4 間接ELISA法評(píng)價(jià)IL1-P30融合蛋白的抗原性

用純化的IL1-P30 融合蛋白包被酶聯(lián)板，用間接ELISA 法初步檢測(cè)了47 例正常人和85 例肺炎支原體患者的血清。結(jié)果70 份患者血清檢出陽(yáng)性，42例正常人血清反應(yīng)陰性，靈敏度和特異性分別為82.35%和89.36%（圖4A），ROC 分析顯示曲線下面積（AUC）為0.9088（圖4B），證明IL1-P30 融合蛋白有較好的抗原活性和特異性。

3 討論

Mp 的早期診斷對(duì)疾病的治療具有重要意義。由于Mp采用偏性密碼子，在大腸桿菌中表達(dá)較為困難，因此臨床應(yīng)用較廣的Mp檢測(cè)試劑如日本富士冷凝集法和歐蒙試劑均采用滅活的Mp 全菌體提取的膜抗原，工藝復(fù)雜，且由于含有大量非活性成分導(dǎo)致試劑的靈敏度低、特異性差。因此，克隆表達(dá)的Mp抗原對(duì)肺炎支原體的診斷具有重要意義。

在Mp基因組表達(dá)的數(shù)百種抗原中，研究較多的是黏附蛋白P1，由于其特殊的定位及在致病中的重要作用而成為研究熱點(diǎn)。我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，P1 蛋白雖具有很好的抗原性，但僅靠P1 進(jìn)行檢測(cè)不能覆蓋所有患者，提示除了P1 抗原外，還存在其他重要的抗原表位[6]。Varshney 等克隆表達(dá)了P30 抗原，用ELISA 法檢測(cè)融合蛋白與Mp 患者血清的反應(yīng)，測(cè)得其靈敏度和特異性分別為78.57%和89.47%[4]，但由于其采用的基因?yàn)橐吧突?，表達(dá)量較低，限制了在診斷和疫苗研制中的應(yīng)用。

本研究采用密碼子優(yōu)化結(jié)合退火延伸PCR 技術(shù)，獲得了CAI 為0.84 的優(yōu)化的P30 基因，并實(shí)現(xiàn)了P30抗原的高效重組表達(dá)，表達(dá)后的P30抗原具有很好的靈敏度和特異性。這為P30 抗原在Mp 檢測(cè)和疫苗中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

圖3 優(yōu)化P30基因的表達(dá)

圖4 P30抗原活性的ELISA鑒定（A）及其特異性分析（B）

[1]Montagnani F,De Paolis F,Beghetto E,et al.Use of recombinant chimeric antigens for the serodiagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection[J].Clin Microbiol Infect Dis,2010,29(11):1377-1386.

[2]袁壯.肺炎支原體肺炎的診治[J].中國(guó)實(shí)用兒科雜志,2008,23(8):561-572.

[3]Drasbek M,Nielsen P K,Persson K,et al.Immune response to Mycoplasma pneumoniae P1 and P116 in patients with atypical pneumonia analyzed by ELISA[J].BMC Microbiol,2004,5:4-7.

[4]Himmelreich R,Hilbert H,Plagens H,et al.Complete sequence analysis of the genome of the bacterium Mycoplasma pneumoniae[J].Nucleic Acids Res,1996,24(22):4420-4449.

[5]Varshney A K,Chaudhry R,Kabra S K,et al.Cloning,expression,and immunological characterization of the P30 protein of Mycoplasma pneumonia[J].Clin Vaccine Immunol.2008,15(2):215-220.

[6]張奇舒,修冰水,宋曉國(guó),等.密碼子優(yōu)化的肺炎支原體P1 蛋白在大腸桿菌中的克隆表達(dá)[J].生物技術(shù)通訊,2012,23(3):380-382.