南雪 ，曾泉，呂洋，姚海雷，陳琳，岳文，裴雪濤

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 a.野戰(zhàn)輸血研究所 全軍干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實驗室，北京 100850；b.華南干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 廣州 510005

原發(fā)性肝癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率高、惡性高、預(yù)后差的惡性腫瘤之一，它的發(fā)病是多因素導(dǎo)致的復(fù)雜過程[1-2]。對于肝癌發(fā)生、復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移分子機(jī)制的探討，依然是目前腫瘤分子生物學(xué)研究領(lǐng)域最為重要的問題之一。與其他惡性腫瘤一樣，肝癌的發(fā)生與發(fā)展是包括原癌基因激活或/和抑癌基因失活的多階段多步驟過程[3-4]。在此過程中，基因突變、染色體擴(kuò)增等基因遺傳學(xué)的改變無疑發(fā)揮著極其重要的作用。此外，表觀遺傳學(xué)的改變，尤其是microRNA（miRNA）表達(dá)改變造成的原癌基因的失活或抑癌基因的沉默也同樣發(fā)揮著重要作用[5-6]。miRNA 是近年發(fā)現(xiàn)的一類長度僅為18～25 個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA，成熟miRNA 的5'非翻譯區(qū)的2～7 個核苷酸的“種子序列”可以與靶mRNA 的3'非翻譯區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平上抑制靶基因的表達(dá)[7-8]。miRNA 在細(xì)胞生長、增殖、發(fā)育和凋亡過程中發(fā)揮重要作用，并與許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。miRNA在腫瘤中發(fā)揮著相當(dāng)于癌基因或抑癌基因的作用，調(diào)節(jié)著腫瘤細(xì)胞的多種重要的生物學(xué)行為[5-8]。近年來，miRNA 調(diào)控腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移的研究成為熱點(diǎn)，包括miRNA-125b等在內(nèi)的許多miRNA被證明在肝癌的發(fā)生與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[9-10]。

我們在前期工作中發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞中miR-155 的表達(dá)，但miR-155 對肝癌細(xì)胞發(fā)揮怎樣的影響有待明確[11]。在以上工作基礎(chǔ)上，我們在Huh7.5.1 及Hcclm3 肝癌細(xì)胞系中過表達(dá)miR-155，發(fā)現(xiàn)miR-155 的表達(dá)明顯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長。

1 材料與方法

1.1 材料

Huh7.5.1 及Hcclm3 肝癌細(xì)胞由本室保存；真核表達(dá)載體pcDNA3.0-miR-155 由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所鄭曉飛教授饋贈；限制性內(nèi)切酶、核酸分子量標(biāo)記等購自寶生物公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實時定量用SYBR Green 染料購自Qiagen 公司；CCK8購自同仁株式會社；高糖培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清購自Hyclone 公司；LipofectAMINE 2000 及TRIzol 購自Invitrogen 公司；引物合成由上海英駿公司完成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

將Huh7.5.1 及Hcclm3 肝癌細(xì)胞接種于6 孔板中，用含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)；用LipofectAMINE 2000 轉(zhuǎn)染細(xì)胞，每孔加入溶解于opti-MEM 的10μL LipofectAMINE 2000和4μg pcDNA3.0-miR-155 質(zhì)粒DNA，對照組加入與實驗組等量的LipofectAMINE 2000和pcDNA3.0 質(zhì)粒DNA；轉(zhuǎn)染第2 d 換液，72 h后收獲細(xì)胞，用于miRNA的實時定量PCR檢測。

1.3 實時定量PCR 檢測miR-155 在細(xì)胞中的表達(dá)水平

轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-miR-155 質(zhì)粒及pcDNA3.0 質(zhì)粒72 h后，用TRIzol提取Huh7.5.1及Hcclm3細(xì)胞的總RNA，經(jīng)酚氯仿抽提純化RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，采用SYBR Green法實時定量PCR 檢測。上游引物為5'-TTAATGCT AATCGTGATAGGGGT-3'，下游引物為5'-GATTGA ATCGAGCACCAGTTAC-3'；PCR 條 件：95℃ 15 min；95℃ 15 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，40 個循環(huán)。以U6 基因為內(nèi)參，上游引物為5'-CGCTTCGGCAG CACATATACTA-3'，下游引物為5'-GATTGAATCG AGCACCAGTTAC-3'；PCR 條件：95℃15 min；95℃15 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，40 個循環(huán)。各組PCR均進(jìn)行3復(fù)孔重復(fù)。

1.4 CCK8法及克隆形成實驗檢測細(xì)胞增殖

1.4.1 CCK8 法檢測 將轉(zhuǎn)染24 h 后的細(xì)胞以每孔2×103/100μL 的密度接種于96 孔板，培養(yǎng)24、72和120 h 后分別進(jìn)行CCK8 檢測。加入10μL CCK8，繼續(xù)在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)4 h，檢測D450nm值，每組均進(jìn)行6復(fù)孔重復(fù)。

1.4.2 克隆形成實驗 轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞以2×103/孔的密度接種于6 孔板，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每3 d 換液，2 周后棄去培養(yǎng)液，用PBS 洗3 次，加入0.1%結(jié)晶紫溶液（含10%福爾馬林）固定20 min，用自來水柔和沖洗，自然干燥，照相保存。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)以x±s表示；應(yīng)用t檢驗進(jìn)行兩均數(shù)間的差異性分析。

2 結(jié)果

2.1 pcDNA3.0-miR-155真核表達(dá)載體的鑒定

用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和XhoⅠ對pcDNA3.0-miR-155 質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在350 bp 及5.4 kb 左右出現(xiàn)條帶，符合預(yù)期結(jié)果（圖1），測序結(jié)果與GenBank中序列一致。

2.2 miR-155 在Huh7.5.1 及Hcclm3 肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)

將Huh7.5.1 及Hcclm3 肝癌細(xì)胞培養(yǎng)至密度80%左右（圖2），轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-miR-155 質(zhì)粒，72 h后對細(xì)胞進(jìn)行實時定量PCR，檢測miR-155的表達(dá)情況，以轉(zhuǎn)染pcDNA3.0質(zhì)粒為陰性對照。結(jié)果顯示陽性組表達(dá)水平比陰性組分別高約431 倍及16 倍（P＜0.01）（圖3），說明pcDNA3.0-miR-155 質(zhì)粒能有效地高表達(dá)成熟的miR-155。

2.3 miR-125b高表達(dá)對細(xì)胞增殖的影響

圖1 pcDNA3.0-miR-155質(zhì)粒的HindⅢ/XhoⅠ雙酶切鑒定

圖2 Hcclm3（A）和Huh7.5.1（B）肝癌細(xì)胞

CCK8 法檢測結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)染pcDNA3.0 陰性對照載體組相比，pcDNA3.0-miR-155 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh7.5.1 及Hcclm3 肝癌細(xì)胞72 h 后細(xì)胞增殖受到明顯促進(jìn)，二者差異非常顯著（P＜0.01）（圖4）。克隆形成實驗是將單細(xì)胞懸液以較低的細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)孔板中，經(jīng)相對較長時間的培養(yǎng)來考察單個細(xì)胞的增殖能力，實驗結(jié)果也說明miR-155 促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的增殖（圖5）。

3 討論

肝癌是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，其發(fā)生是多步驟多因素過程。與其他惡性腫瘤一樣，肝癌依然存在不能早期診斷及預(yù)后差等問題。因此，對其發(fā)生的分子機(jī)理研究依然非常重要。越來越多的研究表明，包括miRNA 在內(nèi)的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制在肝癌的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要角色[4，12-14]。

圖3 實時定量PCR檢測轉(zhuǎn)染72 h后Huh7.5.1及Hcclm3肝癌細(xì)胞中miR-155的表達(dá)

圖4 CCK8法檢測Huh7.5.1及Hcclm3肝癌細(xì)胞的增殖

圖5 克隆形成實驗證明miR-155促進(jìn)Huh7.5.1及Hcclm3肝癌細(xì)胞的增殖

1993 年，Lee 等在線蟲中發(fā)現(xiàn)了首個miRNA；之后Calin 等首次在人的慢性淋巴細(xì)胞白血病中發(fā)現(xiàn)miR-15a及miR-16-1表達(dá)異常；此后越來越多的研究證明miRNA 與腫瘤的增殖、分化及凋亡等相關(guān)，并且在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[15-16]。最新的證據(jù)表明，多種miRNA 在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)生明顯變化，包括let-7、miR-29和miR-122 等在內(nèi)的miRNA 下調(diào)，而miR-21、miR-221、miR-51和miR-517a等多種miRNA顯著上調(diào)[17-20]。探討這些表達(dá)變化的miRNA 對肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，并研究其臨床轉(zhuǎn)化意義，將有助于理解肝癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)理，進(jìn)一步為腫瘤診斷與治療靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)提供理論依據(jù)。

在前期工作中，我們系統(tǒng)研究了肝腫瘤微環(huán)境的變化，并探討這些變化對于肝癌細(xì)胞生物學(xué)活性的影響[11]。研究發(fā)現(xiàn)，微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞呈激活狀態(tài)，其表達(dá)和分泌的活性因子發(fā)生顯著性變化，包括S100A4、MMP1、S100A11、HGF、FGF13、FGF5、CCL13、IL-24、S100A3、CXCL12、Gremlin2和WNT2等（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE42357)，而這些因子的變化無疑將進(jìn)一步影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)活性。我們進(jìn)一步篩選包括S100A4 等在內(nèi)的因素對腫瘤細(xì)胞的影響，尤其關(guān)注腫瘤細(xì)胞內(nèi)miRNA 的變化，發(fā)現(xiàn)miR-155 的表達(dá)發(fā)生了明顯上調(diào)。那么，進(jìn)一步明確miR-155 對肝癌細(xì)胞的生物學(xué)活性，尤其是對腫瘤細(xì)胞增殖活性的影響，將有助于進(jìn)一步了解腫瘤微環(huán)境的分子調(diào)控機(jī)制，具有重要的生物學(xué)意義。

綜上，本研究通過外源性過表達(dá)的分子生物學(xué)手段探討了miR-155 對肝癌細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果初步證明了miR-155 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖活性，對于進(jìn)一步揭示肝癌發(fā)生發(fā)展的病理機(jī)制，尤其是了解腫瘤微環(huán)境在肝癌發(fā)生中的作用具有重要意義。在未來的工作中，我們將進(jìn)一步探索miR-155的作用機(jī)制，明確其發(fā)揮增殖調(diào)控作用的靶基因與分子信號通路，研究結(jié)果將促進(jìn)肝癌發(fā)生機(jī)制及新的腫瘤診療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)。

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