胡井雷，劉景利，楊 帆，徐姍姍，張從祿，劉光磊，田國(guó)彬，孫建宏*

(1.哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司，哈爾濱150069;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，哈爾濱150001)

國(guó)家生物參考品系指用國(guó)際參考品標(biāo)定的，或我國(guó)自行研制的(尚無(wú)國(guó)際參考品者)用于微生物(或其產(chǎn)物)的定性鑒定或疾病診斷的生物試劑、生物材料或特異性抗血清;或指用于定量檢測(cè)某些制品的生物效價(jià)的參考物質(zhì)，其效價(jià)以特定活性單位表示，不以IU表示。它的某些理化性質(zhì)已經(jīng)準(zhǔn)確測(cè)定，主要用于校準(zhǔn)儀器、評(píng)價(jià)測(cè)量方法和確定材料或產(chǎn)品的特性量值，在量值傳遞和保證測(cè)量一致性方面起著重要作用。禽流感病毒 (H5亞型)血凝抑制試驗(yàn)抗原國(guó)家參考品用于檢測(cè)禽流感病毒(H5亞型)制品生物效價(jià)和血液凝集試驗(yàn)以及血凝抑制試驗(yàn)操作過(guò)程中的校驗(yàn)，目前尚無(wú)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品。在檢驗(yàn)工作中除應(yīng)采用平行樣、空白試驗(yàn)、標(biāo)準(zhǔn)曲線等減少誤差的方法外，更應(yīng)廣泛使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來(lái)對(duì)試驗(yàn)的過(guò)程中進(jìn)行檢驗(yàn)，因此在檢驗(yàn)工作中，特別是在某些特殊條件下，需要把標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或參考品和樣品同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或參考品的含量和實(shí)際含量間的差來(lái)檢驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度。

禽流感病毒 (H5亞型)血凝抑制試驗(yàn)抗原國(guó)家參考品的研制就是為了更加準(zhǔn)確的進(jìn)行免疫監(jiān)測(cè)及對(duì)疫苗免疫效果進(jìn)行正確評(píng)價(jià)，對(duì)于檢測(cè)血清中的抗體水平的準(zhǔn)確性的提高具有較大的推進(jìn)作用。研究依據(jù)國(guó)家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的要求［1］和禽流感病毒(H5亞型)血凝抑制試驗(yàn)抗原制造及檢驗(yàn)規(guī)程［2］(以下簡(jiǎn)稱規(guī)程)以及相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)國(guó)家參考品的要求。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗(yàn)采用的病毒為規(guī)程規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)毒株A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)株，由國(guó)家禽流感參考實(shí)驗(yàn)室鑒定、保管和供應(yīng)。SPF雞胚由哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 禽流感病毒(H5亞型)抗原標(biāo)準(zhǔn)品的制備

將禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)株按照規(guī)程的規(guī)定，用生理鹽水作10－5稀釋，然后接種于10日齡SPF雞胚尿囊腔，劑量為0.1 mL/胚，接種后置于37℃孵化箱孵化，將24 h前死亡雞胚棄去，24 h后死亡的雞胚隨時(shí)取出，至72 h，將全部雞胚取出置于2～8℃冷卻，無(wú)菌收獲雞胚尿囊液。將收獲的雞胚尿囊液經(jīng)滅活、無(wú)菌檢驗(yàn)、效價(jià)測(cè)定后，添加保護(hù)劑，保護(hù)劑參照《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》(二○○○年版)規(guī)定的配方和配制方法制備。然后按照每瓶1 mL進(jìn)行精確分裝后凍干，抗原批號(hào)為201001。

1.2.2 物理性狀、剩余水分及真空度測(cè)定 按規(guī)定方法［4］進(jìn)行，應(yīng)符合要求。

1.2.3 無(wú)菌檢驗(yàn) 按規(guī)定的無(wú)菌檢驗(yàn)方法［4］進(jìn)行抽樣檢驗(yàn)。

1.2.4 特異性試驗(yàn) 按規(guī)定HI試驗(yàn)的方法［4］，采用制備的抗原分別對(duì)H5亞型、H7亞型和H9亞型禽流感病毒陽(yáng)性血清、雞新城疫陽(yáng)性血清、減蛋綜合征陽(yáng)性血清進(jìn)行HI試驗(yàn)，鑒定其對(duì)H5亞型反應(yīng)的特異性。

1.2.5 抗原效價(jià)的定值 按照國(guó)家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)要求由8家具有資質(zhì)且事先經(jīng)過(guò)比對(duì)確認(rèn)其定值能力相同的試驗(yàn)室，采用紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)96孔微量板法進(jìn)行標(biāo)定。按照《禽流感H5亞型血凝抑制抗原國(guó)家參考品協(xié)作標(biāo)定操作規(guī)范》進(jìn)行操作。對(duì)被測(cè)參考樣品分別做6次獨(dú)立的測(cè)定，分2個(gè)單元，每個(gè)單元做3次獨(dú)立測(cè)定;2個(gè)單元之間相隔不少于3 d。所獲得的6個(gè)數(shù)據(jù)用描述性統(tǒng)計(jì)方法檢驗(yàn)異常值，如發(fā)現(xiàn)有異常值，應(yīng)予標(biāo)明，并補(bǔ)做1次測(cè)定。最后報(bào)出全部結(jié)果。匯總?cè)吭紨?shù)據(jù)，采用描述性統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行分析，剔除異常值，確定適宜范圍及眾數(shù)。

1.2.6 均一性檢驗(yàn) 按照國(guó)家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)要求隨機(jī)抽取樣品15支，用電子分析天平分別稱量每支內(nèi)容物的凈重量，用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析其均一性。按照國(guó)家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)要求被檢組數(shù)據(jù)差異應(yīng)不顯著，變異系數(shù)在5%以內(nèi)。

1.2.7 穩(wěn)定性檢驗(yàn) 按照國(guó)家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)要求，抗原在－20℃、4℃、37℃條件下保存，并定期進(jìn)行HA價(jià)測(cè)定，每一時(shí)間均要進(jìn)行2次重復(fù)測(cè)量，用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法從統(tǒng)計(jì)上剔除可疑值，再計(jì)算每次的平均值，該值與定值的偏差應(yīng)不大于標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果

2.1 禽流感病毒 HI抗原標(biāo)準(zhǔn)品物理性狀檢驗(yàn)HI抗原凍干制品均為灰白色海綿狀疏松團(tuán)塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液后能迅速溶解。

2.2 無(wú)菌檢驗(yàn) HI抗原凍干制品無(wú)菌檢驗(yàn)結(jié)果均符合規(guī)定。

2.3 剩余水分測(cè)定 四次剩余水分含量測(cè)定結(jié)果分別為 2.12%、2.07%、1.94% 和 1.32%，均小于3%，符合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的要求。

2.4 真空度測(cè)定 所有安瓶真空度均呈紫色輝光，均符合要求。

2.5 特異性試驗(yàn) 抗原特異性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，201001抗原只能被H5亞型陽(yáng)性血清所抑制，而對(duì)H7、H9、新城疫陽(yáng)性血清、雞減蛋綜合征陽(yáng)性血清均呈陰性反應(yīng)。

2.6 抗原效價(jià)的定值 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果見(jiàn)表1。經(jīng)描述性統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，該批抗原血凝價(jià)為1∶(160±80)，由于數(shù)據(jù)是非連續(xù)的，剔除少量異常值，適合看眾數(shù)。眾數(shù)是1∶80，因此將HA效價(jià)定值為1∶80，即 80 HAU/支。

表1 抗原效價(jià)協(xié)作標(biāo)定結(jié)果

2.7 均一性檢驗(yàn) 樣品重量在0.1164～0.1260 g之間。描述性生物統(tǒng)計(jì)分析得出:樣品重量平均數(shù)為0.1208 g變異系數(shù)(CV)為4.3%，被檢組數(shù)據(jù)經(jīng)生物統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果分析為差異不顯著表明該批參考品裝量均一。

2.8 穩(wěn)定性檢驗(yàn) 該抗原在37℃條件下保存35天HA價(jià)未下降，42 d略有降低，結(jié)果見(jiàn)表2。4℃保存6個(gè)月和－20℃保存24個(gè)月時(shí)HA價(jià)未下降，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上亦無(wú)差異，說(shuō)明該批制品穩(wěn)定性良好。

表2 37℃保存的穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

3 討論

H5亞型在禽流感病毒中具有重要的地位，本實(shí)驗(yàn)室在研制出禽流感病毒(H9亞型)血凝抑制試驗(yàn)抗原國(guó)家參考品后［5］，依據(jù)國(guó)家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的要求和禽流感病毒(H5亞型)血凝抑制試驗(yàn)抗原制造及檢驗(yàn)規(guī)程中的規(guī)定，結(jié)合了相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)研制出禽流感病毒(H5N1亞型)血凝抑制試驗(yàn)抗原國(guó)家參考品。該參考品經(jīng)全面檢測(cè)后完全符合國(guó)家參考品的各項(xiàng)指標(biāo)要求。

根據(jù)國(guó)家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的要求本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研制的禽流感抗原國(guó)家參考品的定值只能由多家具有資質(zhì)和HI檢測(cè)能力的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定確定，綜合考慮實(shí)驗(yàn)室的水平、地域分布等因素，我們?cè)趪?guó)內(nèi)選擇了8家HI檢測(cè)水平較高的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了統(tǒng)一的協(xié)作標(biāo)定，目的就是對(duì)國(guó)家參考品進(jìn)行精確定值。由于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是需要一個(gè)相對(duì)較長(zhǎng)的保存過(guò)程，所以在保存期試驗(yàn)中，我們也將會(huì)對(duì)在－70℃條件下保存的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)每年定期進(jìn)行測(cè)定。

［1］ 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心.一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范(JJClf)06－94)［S］.1994.

［2］ 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.禽流感病毒H5亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原與陰、陽(yáng)性血清制造及檢驗(yàn)試行規(guī)程［S］.2006.

［3］ 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程二○○○年版［S］.

［4］ 中華人民共和國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典二○一○年版［S］.

［5］ 孫建宏，劉景利，胡井雷，等.禽流感病毒H9亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原國(guó)家參考品的研制［J］.中國(guó)獸藥雜志，2013，47(4):17－19.