高 鐸，孔令聰，王 梓，馬紅霞.2*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春130118;2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室，長春130118)

牛支原體(Mycoplasma bovis，M.bovis)是引起肉牛和奶牛多種疾病的重要病原體，其中以引發(fā)呼吸系統(tǒng)疾病最為常見［1］。自1961年從美國首次分離到牛支原體以來，全世界大多數(shù)國家都已經(jīng)發(fā)生牛支原體引起疾病的相關(guān)疫情。2008年，辛九慶等首次在國內(nèi)患肺炎的犢牛肺臟中分離到M.bovis，從而證實了我國部分地區(qū)發(fā)生了牛支原體肺炎疫情［1］。M.bovis的16S rRNA 序列與無乳支原體的16S rRNA 序列差異僅有 0.53%［2］，且其引起的肺炎在臨床癥狀和病理剖檢變化上與牛傳染性胸膜肺炎均極為相似，這些既給牛支原體的臨床診斷造成了困難，又給我國畜牧養(yǎng)殖業(yè)帶來了恐慌。為此，本試驗在對牛支原體進行分離、鑒定的基礎(chǔ)上，進一步對其進行了耐藥性檢測，以期為獸醫(yī)臨床用藥提供一定的試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病料來源 分別采自吉林省不同地區(qū)肉牛養(yǎng)殖場患呼吸系統(tǒng)疾病病牛的肺臟等組織。

1.2 主要試劑 Taq酶、dNTPs、DNA Marker 2000等均購自TakaRa公司。PPLO肉湯培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限責(zé)任公司。紅霉素等6種抗生素標(biāo)準(zhǔn)品均購自中國藥品生物制品檢定所。DMEM培養(yǎng)基購自Invitrogen生命科技有限公司。細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒購自生工生物工程有限公司。

1.3 病原分離鑒定 將肺臟等組織樣本接種于改良的PPLO(Pleuropneumonia－Like Organisms)液體培養(yǎng)基中［3］，于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，將由紅色變?yōu)辄S色且澄清透明的培養(yǎng)液進行傳代培養(yǎng)，再次出現(xiàn)顏色變化的培養(yǎng)液涂布于改良的PPLO固體培養(yǎng)基中，于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，繼而在40倍普通光學(xué)顯微鏡下觀察菌落形態(tài)。牛支原體菌落具有“油煎蛋”樣典型特征，經(jīng)三次克隆純化后保存菌種。

1.4 分子生物學(xué)鑒定 使用生工生物工程有限公司的細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取牛支原體基因組，并參考Rifatbegovic M等［4］合成牛支原體oppD/F基因特異性引物對疑似菌株進行特異性PCR鑒定，使用實驗室保存的牛支原體做陽性對照，同時設(shè)陰性對照，預(yù)計擴增出1912 bp的目的條帶。

牛支原體和無乳支原體的16S rRNA序列差異僅有 0.53%［2］。為此，本實驗參考 Yleana R［5］等設(shè)計的16S rRNA引物，對牛支原體與無乳支原體的差異堿基進行分析，繼而區(qū)分牛支原體和無乳支原體。

1.5 顏色變化單位(CCU)測定 取11支無菌試管，每管加入1.8 mL PPLO肉湯培養(yǎng)基，于第1管加入0.2 mL菌液，充分混勻后吸取0.2 mL加入到第2管，依此類推作10倍梯度稀釋至第10管，第11管不加菌液作為陰性對照，置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，以培養(yǎng)液的顏色不發(fā)生變化為終點對其結(jié)果進行判定，發(fā)生顏色變化的最高稀釋度為顏色變化單位。支原體學(xué)推薦使用的支原體菌液最佳濃度為 103～104CCU/0.2mL［6］。

1.6 MIC的測定 根據(jù)CLSI的指導(dǎo)方針［7］，參考支原體學(xué)［6］，將各抗生素溶解并稀釋成2048 μg/mL的抗生素貯存液，采用改良的微量稀釋法藥物敏感性實驗測定M.bovis對藥物的體外敏感性。

2 結(jié)果

2.1 臨床分離的牛支原體菌落形態(tài) 牛支原體在低倍顯微鏡下呈典型的“油煎蛋”樣，圓形，邊緣整齊，周邊為一層薄薄的透明顆粒區(qū)，為菌落在瓊脂表面散開的生長部分;中央部分較厚，顆粒狀，為陷入瓊脂內(nèi)部的生長部分。如圖1所示。

圖1 M.bovis的菌落形態(tài)(40×)

2.2 臨床分離的牛支原體分子生物學(xué)鑒定 利用牛支原體oppD/F基因特異性引物擴增出1912 bp的片段，與預(yù)期片段大小相符。結(jié)果如圖2所示。

圖2 M.bovis的oppD/F基因的擴增結(jié)果

通過Yleana R［5］等設(shè)計的16S rRNA引物擴增出360 bp的片段，與預(yù)期片段大小相符，測序后對其堿基序列進行BLAST分析顯示，所分離菌株的16S rRNA相應(yīng)序列與模式株P(guān)G45的相應(yīng)序列同源性為100%，與無乳支原體PG2的相應(yīng)序列同源性為98%。證明所分離的4株疑似菌株均為牛支原體，而非無乳支原體。結(jié)果如圖3所示。

圖3 M.bovis的16S rRNA基因的擴增結(jié)果

2.3 MIC測定結(jié)果 改良的微量稀釋法測定4株牛支原體的MIC值顯示，所有菌株均對泰樂菌素耐藥(MIC≥64 μg/mL)，對紅霉素和阿奇霉素高度耐藥(MIC≥256 μg/mL);所有菌株均對強力霉素相對敏感(MIC≤2 μg/mL)，對環(huán)丙沙星、恩諾沙星相對敏感(MIC≤0.5 μg/mL)(表1)。

表1 6種抗生素對四株牛支原體的藥敏實驗結(jié)果(μg·mL-1)

3 討論

本試驗從吉林省不同地區(qū)肉牛養(yǎng)殖場患呼吸系統(tǒng)疾病病牛的肺臟等組織分離病原菌。采用形態(tài)學(xué)觀察，并經(jīng)分子生物學(xué)手段對臨床分離菌進行鑒定，最終確定所分離的四株菌株均為牛支原體，并非無乳支原體或絲狀支原體。牛支原體是呈世界性分布的重要傳染病病原，其引發(fā)的疾病已給國外養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失［8－9］，近年來我國多個省市也陸續(xù)出現(xiàn)牛支原體肺炎的相關(guān)報道［1，3，10］，其病原分離情況與本研究相似，均分離自經(jīng)長途運輸后患呼吸系統(tǒng)疾病的育肥架子牛中。

本實驗采用改良的微量稀釋法測定了四株M.bovis的MIC值。改良的微量稀釋法與傳統(tǒng)微量稀釋法相比，具有滅菌處理簡便、可重復(fù)性好等特點。受試藥物的敏感折點值判斷標(biāo)準(zhǔn)主要參考Ricardo F Rosenbusch［11］等的建議。其結(jié)果表明，四株 M.bovis均對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥，建議臨床上暫時停止使用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療M.bovis引起的疾病。此外，四株M.bovis均對環(huán)丙沙星等氟喹諾酮類抗生素、強力霉素等較為敏感。此結(jié)果與國外報道的M.bovis的耐藥情況較為一致，均表現(xiàn)對大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥，且對氟喹諾酮類及四環(huán)素類抗生素較為敏感。David Francoz等使用E test測定了58株牛支原體的MIC值，所有菌株均對紅霉素高度耐藥(MIC≥256 μg/mL)，部分菌株對阿奇霉素高度耐藥(MIC≥256 μg/mL)，多數(shù)菌株對恩諾沙星較為敏感(MIC≤0.5 μg/mL)［12］。Irena Gerchman 等分別使用微量稀釋法與E test對進口與本地牛中分離的牛支原體的MIC值進行測定，結(jié)果也顯示這些菌株對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素高度耐藥，對氟喹諾酮類抗生素、四環(huán)素類抗生素敏感［13］。在實驗室鑒定的基礎(chǔ)上對其進行合理的用藥是治療牛支原體引起疾病的有效措施。

［1］ 辛九慶，李 媛，郭 丹，等.國內(nèi)首次從患肺炎的犢牛肺臟中分離到牛支原體［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2008，30(9):661－664.

［2］ 辛九慶，李 媛，董 惠，等.牛支原體套式PCR檢測方法的建立［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2009，31(9):709－711.

［3］ 石 磊，龔 瑞，尹爭艷，等.肉牛傳染性牛支原體肺炎流行的診斷［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2008，27(5):629－633.

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［6］ 吳移謀，葉元康.支原體學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2008:16－25.

［7］ CLSI.Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated From Animals;Approved Standard－Fourth Edition.CLSI document VET01－A4.Wayne，PA:Clinical and Laboratory Standards Institute;2013.

［8］ Marie － Anne Arcangioli，Arnaud Duet，Gilles Meyer，et al.The role of Mycoplasma bovis in bovine respiratory disease outbreaks in veal calf feedlots［J］.The Veterinary Journal，2008，177:89 －93.

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［10］冉智光，謝建華，駱 璐，等.我國部分地區(qū)牛支原體肺炎和關(guān)節(jié)炎的病原體診斷［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2010，32(1):40－43.

［11］ Ricardo F Rosenbusch，Joann M Kinyon，Michael Apley，et al.In vitro antimicrobial inhibition profiles of Mycoplasma bovis isolates recovered from various regions of the United States from 2002 to 2003 ［J］.Vet Diagn Invest，2005，17:436 – 441.

［12］ David Francoz，Mado Fortin，Gilles Fecteau，et al.Determination of Mycoplasma bovis susceptibilities against six antimicrobial agents using the E test method［J］.Veterinary Microbiology，2005，105:57 －64.

［13］ Irena Gerchman，Sharon Levisohn，Inna Mikula，et al.In vitro antimicrobial susceptibility of Mycoplasma bovis isolated in Israel from local and imported cattle［J］.Veterinary Microbiology，2009，137:268－275.