張 聰，趙秋君，張 閣

(1.國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，洛陽471003;2.洛陽惠中獸藥有限公司，洛陽471013)

芩黃顆粒是在《傷寒論》“麻杏石甘湯”處方基礎(chǔ)之上，經(jīng)藥味加減后研制開發(fā)的中藥復(fù)方顆粒劑，已取得農(nóng)業(yè)部三類新獸藥注冊證書。該制劑由黃芩、板藍(lán)根、甘草、山豆根、麻黃、桔梗六味中藥組成，具有清熱解毒、止咳平喘的功效，臨床用于雞傳染性支氣管炎的預(yù)防及輔助治療。為建立芩黃顆?？煽氐馁|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，研究采用高效液相色譜法測定了芩黃顆粒中甘草酸的含量。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Waters高效液相色譜系統(tǒng)(e2695型高效液相色譜儀;2489型紫外檢測器;empower 2色譜軟件);Agilent HC －C18柱，4.6 mm ×150 mm，5 μm(安捷倫公司，美國);AB265－S電子分析天平;HS3120型超聲波清洗器。

1.2 試劑 甘草酸銨對照品，批號(hào):121028－200507，中國藥品生物制品檢定所;芩黃顆粒由洛陽惠中獸藥有限公司提供;甲醇為色譜純，水為重蒸水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取方法選擇 精密稱取樣品2 g，置50 mL量瓶中，加流動(dòng)相40 mL，超聲提取60 min，放冷，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻;另精密稱取樣品2 g，置100 mL圓底燒瓶中，加流動(dòng)相40 mL，90℃水浴回流提取60 min，放冷，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，用流動(dòng)相洗滌圓底燒瓶，洗液合并入提取液中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。取以上兩種提取液，濾過，取續(xù)濾液測定，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，兩種提取方法甘草酸含量測定結(jié)果相差不大，考慮到超聲提取操作簡單，故選擇超聲提取的方法。

表1 不同提取方法對樣品含量的影響 (n=3)

2.2 提取時(shí)間選擇 精密稱取樣品2 g，置50 mL量瓶中，用流動(dòng)相作溶劑，加入40 mL，分別超聲提取10、20、30、40、60 min，放冷，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液測定，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，隨著提取時(shí)間的增加，提取液中甘草酸的含量逐漸增加，當(dāng)提取時(shí)間超過30 min后，提取液中甘草酸的含量趨于穩(wěn)定，說明超聲30 min甘草酸提取已比較完全，故選擇超聲提取時(shí)間為30 min。

表2 不同提取時(shí)間對樣品含量的影響 (n=3)

2.3 甘草酸的含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Agilent HC－C18柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm);流動(dòng)相為甲醇 －0.2 mol/L醋酸銨(65∶34，醋酸調(diào)節(jié)pH值至4.5);流速為1.0 mL/min;檢測波長為 250 nm;進(jìn)樣量 10 μL。

2.3.2 甘草酸對照品溶液制備 精密稱取甘草酸銨對照品10.72 mg，置50 mL量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液(甘草酸重量=甘草酸銨重量/1.0207)。

2.3.3 供試品溶液制備 精密稱取芩黃顆粒2 g，置50 mL量瓶中，加流動(dòng)相適量，超聲提取30 min，放冷，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，用濾膜濾過，精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。

2.3.4 專屬性考察 按芩黃顆粒處方及工藝制備缺甘草的陰性對照樣品，按上述2.3.3項(xiàng)方法制成陰性對照溶液。分別精密吸取甘草酸對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明，陰性對照溶液在甘草酸對照品相應(yīng)的保留時(shí)間處無干擾，見圖1。

圖1 專屬性考察液相色譜圖

2.3.5 線性關(guān)系考察 精密稱取甘草酸銨對照品適量，加流動(dòng)相溶解制成濃度為0.1994 mg/mL的甘草酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液2.5、5、10、20、40 μL，注入高效液相色譜儀，以甘草酸峰面積(y)為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量(x)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為 y=656.36x+5.8095(r=0.9999)。結(jié)果表明，甘草酸在 0.499 ～ 7.976 μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.3.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取甘草酸對照品溶液(0.1994 mg/mL)10 μL，注入高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得甘草酸峰面積RSD為1.1%，結(jié)果表明，本方法精密度良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)的芩黃顆粒(批號(hào):0501)2 g，按上述2.3.3項(xiàng)方法制備供試品溶液，平行制備6份，測得甘草酸的平均含量為4.9 mg/g，RSD為2.5%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣測定，測得甘草酸峰面積的RSD為1.8%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的芩黃顆粒1 g，置50 mL量瓶中，精密加入甘草酸對照品儲(chǔ)備液(0.8044 mg/mL)5 mL，平行操作6份，按2.3.3項(xiàng)方法制備加樣回收供試品溶液，測定并計(jì)算加樣回收率，測得平均回收率為99.3%，RSD為0.59%，表明方法準(zhǔn)確度良好，結(jié)果見表3。

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.3.10 樣品測定 取3批芩黃顆粒，依法制備供試品溶液并測定，計(jì)算甘草酸的含量，結(jié)果見表4。

表4 樣品含量測定結(jié)果(n=3)

3 討論

甘草具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、止咳祛痰等功效，為本方之臣藥，臨床藥理作用主要有鎮(zhèn)咳祛痰、清熱解毒、抗炎等，其主要有效成分為甘草酸和甘草次酸［1］，故本試驗(yàn)對甘草酸進(jìn)行含量測定。

文獻(xiàn)報(bào)道的甘草酸含量測定方法主要為高效液相色譜法［2－4］等，高效液相色譜法具有分離效能高、分析速度快、靈敏度高等特點(diǎn)，因此本研究采用高效液相色譜法對甘草酸進(jìn)行測定。已有較多學(xué)者研究報(bào)道高效液相色譜法測定甘草酸的含量，其流動(dòng)相系統(tǒng)主要有:乙腈 －水 －磷酸系統(tǒng)［5］，乙腈 － 水 － 醋酸系統(tǒng)［2］，甲醇 － 水 － 醋酸銨－醋酸系統(tǒng)［4］，本研究過程中對乙腈－1%醋酸(33∶67)和甲醇 －0.2 mol/L醋酸銨 － 醋酸(65∶34∶1)2種流動(dòng)相進(jìn)行了比較，結(jié)果甲醇－0.2 mol/L醋酸銨－醋酸(65∶34∶1)系統(tǒng)中甘草酸分離度稍好，但分離度未達(dá)要求，用醋酸將pH調(diào)至4.5時(shí)，甘草酸的分離效果較好，分離度＞1.5，因此，將流動(dòng)相調(diào)整為甲醇－0.2 mol/L醋酸銨(65∶34，醋酸調(diào)節(jié) pH 值至4.5)。

本研究為建立了高效液相色譜法測定芩黃顆粒中甘草酸的含量，在該流動(dòng)相條件下，甘草酸分離度良好，方法學(xué)考察表明該方法專屬性、精密度、重復(fù)性良好，測定結(jié)果準(zhǔn)確，可有效控制芩黃顆粒中甘草酸的含量，并為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

［1］ 梁 冰，楊愛馥，黃鳳蘭，等.甘草屬(Glycyrrhiza)化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，37(1):115－119.

［2］ 楊先炯，王愛民，李勇軍，等.高效液相色譜法測定珍珠滴丸中甘草酸含量［J］.中國藥業(yè)，2008，17(3):12－13.

［3］ 王二兵，曲婷麗，趙正保.HPLC法測定參苓白術(shù)顆粒中甘草酸的含量［J］.山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，39(1):38－40.

［4］ 王申東，胡 斯.HPLC測定蘇菲止咳糖漿中甘草酸銨的含量［J］.中成藥，2005，27(11):7－8.

［5］ 中國獸藥典委員會(huì).《中華人民共和國獸藥典》二○一○年版二部［S］.