劉俊渤，王艷玲，唐珊珊，常海波，梁大棟

(吉林農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，長春130118)

近年來，分子印跡聚合物(MIPs)因其具有良好的物理和化學穩(wěn)定性［1］，較高的親合性和靈敏度［2－3］，可從復雜基質(zhì)中快速分離、純化及富集待測物而被作為選擇性固相萃取吸附劑材料應用于食品安全監(jiān)測領域［4－6］。實際合成 MIPs過程中，模板分子與功能單體的結(jié)合過程是MIPs制備的關鍵步驟，尤其是兩者的比例直接影響MIPs的吸附性及選擇性［7－8］。目前，文獻中恩諾沙星分子印跡聚合物(ENRO－MIPs)制備多采用甲基丙烯酸(MAA)作為功能單體，恩諾沙星(ENRO)與MAA的比例分別為 1∶4［9－10］、1∶6［11］或 1∶8［12－13］，存在較大差異。因此本研究以ENRO為模板分子，MAA為功能單體，采用沉淀聚合法合成ENRO－MIPs，優(yōu)化模板分子與功能單體的比例、溶劑種類及溶劑用量，并通過靜態(tài)吸附法研究MIPs的吸附性與選擇性。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 ENRO、CIP和 OFL，純度 ＞98%，上海源葉生物科技有限公司;MAA、偶氮二異丁腈(AIBN)、乙腈(ACN)、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)、N，N－二甲基甲酰胺(DMF)、三氯甲烷、甲苯、甲醇、乙酸、磷酸，均為分析純。T6新世紀紫外可見分光光度計、HH－S恒溫水浴鍋、THZ－82A型水浴恒溫振蕩器、KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器、FA2104N電子天平、DZF－6020真空干燥箱、JSM－6510掃描電子顯微鏡。

1.2 MIPs和NIPs的制備 稱取一定比例的ENRO和MAA于溶劑中超聲溶解，靜置24 h，再加入一定量的EDMA(功能單體MAA與交聯(lián)劑EDMA的摩爾比為1∶5)和50 mg的AIBN，超聲30 min，充氮脫氧，密封，置于60℃水浴鍋中反應24 h。反應結(jié)束后將聚合產(chǎn)物離心，用乙酸/甲醇(2/8，V/V)溶液索氏提取，直至洗脫的溶液中檢測不到ENRO為止，再用甲醇洗至中性，處理完畢后50℃真空干燥至恒重，得到MIPs。

NIPs制備過程除不加模板分子ENRO外，其余過程與其MIPs制備條件相同。

1.3 MIPs和NIPs的靜態(tài)吸附性試驗 稱取20.0 mg已洗脫、干燥的MIPs，置于50 mL具塞三角瓶中，加入5 mL不同濃度ENRO溶液，放入28℃恒溫振蕩器中振蕩20 h，取上清液用0.22 μm的濾頭過濾，稀釋一定的濃度，用紫外分光光度計測定ENRO的游離濃度，根據(jù)結(jié)合前后ENRO濃度的變化計算MIPs對ENRO的結(jié)合量Q。NIPs的結(jié)合量Q的變化測定方法與MIPs一致。

其中，Q為MIPs(或NIPs)對ENRO的吸附量(mg/g)，c0、c分別為ENRO的初始濃度和吸附后的濃度(mg/L)，V為吸附溶劑的體積(mL)，W為MIPs(或NIPs)微球的質(zhì)量(mg)。

1.4 MIPs和NIPs的選擇性試驗 稱取20 mg洗脫、干燥后的納米聚合物(MIPs或NIPs)，分別加入到5 mL初始濃度為100 mg/L的CIP、OFL與ENRO的溶液中，28℃恒溫水浴振蕩器中振蕩20 h。吸附平衡后用0.22 μm的濾頭過濾，稀釋一定的濃度，在不同吸光度條件下測定溶液中CIP、OFL與ENRO的游離濃度(OFL在295 nm，CIP在275 nm，ENRO在278 nm)。平行測定3次，取平均值。

1.5 MIPs循環(huán)利用試驗 稱取20.0 mg的MIPs，置于50 mL具塞三角瓶中，加入5 mL不同濃度ENRO－磷酸溶液，放入28℃恒溫振蕩器中振蕩，20 h后用紫外分光光度計測定平衡濃度，并將達到飽和的MIPs回收，用乙酸/甲醇(2/8，V/V)溶液洗脫，再用甲醇洗至中性，處理完畢后50℃真空干燥至恒重。重復上述步驟，研究MIPs的使用壽命以及反復利用的吸附效果。

1.6 MIPs和 NIPs的表征 用甲醇將 MIPs(或NIPs)溶液稀釋到一定濃度，超聲30 min，滴于硅片上，自然烘干后噴金，采用JSM－6510掃描電鏡觀測MIPs(或NIPs)微球的大小及形貌，并用Nano Measurer 1.2軟件統(tǒng)計微球粒徑。同時采用Spectrum 100紅外光譜儀對制備的MIPs(或NIPs)進行表征。

2 結(jié)果與討論

2.1 MIPs的制備

2.1.1 模板分子與功能單體比例的優(yōu)化 固定其他條件，改變模板分子與功能單體的比例分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7 和1∶8，測定不同比例MIPs的吸附量，見圖1。圖1可以明顯看出模板與功能單體比例為1∶4的MIPs吸附量最大。這說明分子印跡過程中模板分子與功能單體比例的選擇非常重要，它不僅影響印跡分子的鍵合速度與釋出，而且還制約著MIPs的吸附性。ENRO與MAA最佳結(jié)合比例為1∶4的MIPs結(jié)構(gòu)見圖2。

圖1 ENRO與MAA不同比例MIPs的吸附量

圖2 ENRO與MAA1∶4比例的MIPs結(jié)構(gòu)

2.1.2 溶劑種類及用量的優(yōu)化 試驗討論了甲苯、三氯甲烷、DMF及ACN四種溶劑對微球形態(tài)與粒徑大小的影響。試驗結(jié)果顯示:甲苯對于ENRO溶解性極差，以三氯甲烷為溶劑得到油狀MIPs，以DMF為溶劑生成的MIPs呈凝膠狀態(tài)，而以ACN為溶劑制備的MIPs體系為分散均勻、穩(wěn)定，體系粘度低的乳液。沉淀聚合制備MIPs過程中，溶劑對MIPs微球形態(tài)與粒徑大小起關鍵作用［14－15］。所選用的溶劑必須能溶解功能單體、模板分子、交聯(lián)劑等，但對MIPs不溶才能使MIPs沉淀成核，而所選用的溶劑對MIPs的溶解性太好或者太差都會導致MIPs形成微凝膠或者不規(guī)則微粒。

沉淀聚合的機理決定了反應溶劑的體積對MIPs的形成起到關鍵作用［16］，溶劑量少會導致MIPs結(jié)塊，即本體聚合;溶劑量太大，會導致聚合度過低不能形成微球沉淀或者微球形態(tài)不均。試驗改變ACN的用量(15、30、45 mL)制備 ENROMIPs，其掃描電鏡見圖3。當 ACN用量為15 mL，MIPs(圖3A)分散性不好，粘連度高，幾乎成塊狀，微粒不規(guī)則且粒徑大，其吸附量為4.02 mg/g;當ACN用量為30 mL，MIPs(圖3B)分散性好，大小均一，近似球形，且粒徑小，吸附量增加，為6.28 mg/g;當ACN用量為45 mL，MIPs(圖3C)微球大小不均，粒徑范圍較寬(130～270 nm)，合成率低，其吸附量為4.78 mg/g。所以，在試驗的條件下，優(yōu)化ACN的最佳用量為30 mL。

圖3 MIPs在不同溶劑ACN用量條件下的掃描電鏡圖

2.2 MIPs和NIPs的電鏡表征 利用掃描電子顯微鏡對制備得到的MIPs(圖4A)和NIPs(圖4B)進行表征。通過Nano Measurer1.2軟件統(tǒng)計，MIPs的粒徑范圍是190～290 nm，而NIPs的粒徑在120～230 nm。這說明模板分子ENRO占有一定的空間，洗脫之后留下特異性識別的孔穴。

圖4 MIPs和NIPs的掃描電鏡照片

2.3 紅外分析 紅外光譜可反映MIPs的結(jié)構(gòu)信息，MIPs和NIPs紅外光譜見圖5。從圖中可以看出，MIPs和NIPs紅外光譜相近，但單體MAA特征基團C=O、O－H振動峰的位置、寬度和強度有明顯差別。1740 cm－1處是C=O振動吸收峰，ENRO模板分子加入形成ENRO－MIPs后，上述譜帶紅移至1729 cm－1處，這是因MAA分子中的C=O與ENRO的質(zhì)子給體C－H或O－H形成氫鍵，使C=O鍵弱化所致(圖2)。圖5還可看到，NIPs在3450 cm－1處有羧酸中O－H的伸縮振動吸收峰，而MIPs中OH的吸收峰在3436 cm－1，其吸收峰不僅加寬、增強且譜帶向低頻率方向紅移了14 cm－1，這表明單體MAA分子中的質(zhì)子給體O－H與模板ENRO分子的質(zhì)子受體C=O可形成較強的氫鍵(圖2)。

圖5 MIPs和NIPs的紅外圖譜

2.4 ENRO－MIPs的吸附性能 使用靜態(tài)吸附法測定MIPs和NIPs對不同濃度的ENRO的吸附等溫線，見圖6。從圖6可以看出，在ENRO的初始濃度為800 mg/L時，無論是MIPs還是NIPs都達到最大飽和吸附量。MIPs最大飽和吸附量為25.07 mg/g，NIPs最大飽和吸附量為13.05 mg/g。隨著ENRO濃度的增加，MIPs和NIPs對ENRO的吸附量逐漸增加，且在相同初始濃度下單位質(zhì)量MIPs的吸附量遠大于單位質(zhì)量NIPs的吸附量，這表明MIPs對ENRO具有較好的印跡效果。兩者吸附量的差別主要是因為MIPs納米微球中存在特異的結(jié)合位點，選擇了在氫鍵作用活性位點、分子大小及空間結(jié)構(gòu)互補的印跡分子ENRO，因此吸附主要以特異性吸附為主，而NIPs只能依靠非特異性吸附，吸附能力較弱。

在分子印跡的研究中，通常用Scatchard來分析制備的MIPs的結(jié)合性能，Scatchard方程式為:

其中c為溶液吸附平衡濃度(mg/L)，Q為平衡吸附量(mg/g)，Qmax最大飽和吸附量，Kd為平衡離解常數(shù)。

圖6 MIPs和NIPs對ENRO的靜態(tài)吸附性

以Q為橫坐標，Q/c為縱坐標作圖，得到Scatchard分析圖(圖7)。由圖7可以看出，Q/c對Q呈非線性關系，表明在所研究的ENRO濃度范圍內(nèi)，MIPs主要存在兩個結(jié)合位點。其擬合的線性方程分別為Q/c=150.2547－4.3228Q和Q/c=98.3218－1.7119Q，由直線的斜率和截距可以得到高親和性位點的離解常數(shù)為Kd1=0.2313 g/L，最大表觀結(jié)合量Qmax1=34.7540 mg/g;低親和性位點的離解常數(shù)為Kd2=0.5841 g/L，最大表觀結(jié)合量 Qmax2=57.4298 mg/g。與已有文獻［17］相比，該條件下制備的MIPs具有更好的結(jié)合性。

圖7 MIPs對ENRO的Scatchard分析圖

2.5 選擇吸附性能研究 為了進一步研究制備的MIPs和NIPs對ENRO的選擇吸附性。本試驗選擇了與ENRO結(jié)構(gòu)相似的CIP和OFL作為底物，利用等溫平衡吸附的方法測定MIPs和NIPs對ENRO、CIP和OFL的吸附量，結(jié)果如圖8。

圖8 MIPs與NIPs對ENRO、CIP和OFL的選擇吸附性

從圖8可以看出，MIPs對ENRO的吸附性明顯高于MIPs對CIP、OFL的吸附性，表現(xiàn)出較強的特異吸附行為。而NIPs對ENRO、CIP、OFL三者的吸附量很接近，表明其吸附是廣泛的，沒有選擇性。MIPs和NIPs的這種差異表明它們之間的結(jié)構(gòu)顯著不同，原因在于MIPs中存在著與模板分子ENRO空間結(jié)構(gòu)和官能團的結(jié)合位點相互補的孔穴。這些孔穴對模板分子ENRO表現(xiàn)出特異的吸附能力，而在NIPs合成時沒加模板分子，也就沒有空間結(jié)構(gòu)互補的孔穴，所以只表現(xiàn)出一般的吸附性。

2.6 MIPs的循環(huán)使用性能 采用相同的洗脫處理方法，經(jīng)過反復的吸附－洗脫試驗研究了MIPs循環(huán)使用性能，表1為MIPs的使用次數(shù)、MIPs對ENRO的吸附量以及MIPs的回收損失率。在使用四次后MIPs的吸附率為92.05%，說明MIPs可以反復使用。

表1 MIPs的循環(huán)使用性

3 結(jié)論

采用沉淀聚合法合成ENRO－MIPs，優(yōu)化模板分子與功能單體的比例、溶劑種類及溶劑用量。按最佳比例1∶4合成的MIPs對ENRO模板分子表現(xiàn)較強的特異性吸附能力，且離解平衡常數(shù)和最大表觀結(jié)合量分別為 Kd1=0.2313 g/L、Qmax1=34.7540 mg/g、Kd2=0.5841 g/L、Qmax2=57.4298 mg/g，且具有較好的循環(huán)使用性。本研究為ENRO－MIPs的選擇性分離、富集和檢測復雜基質(zhì)食品樣品中的ENRO提供了參考依據(jù)。

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