于曉劍，王 燕，李瑞峰，李 莉，劉玉剛

(山東大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)與病理生理學(xué)研究所，山東 濟(jì)南 250012)

研究論文

microRNA- 34c調(diào)控c-Met抑制肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展

于曉劍，王 燕，李瑞峰，李 莉，劉玉剛*

(山東大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)與病理生理學(xué)研究所，山東 濟(jì)南 250012)

目的探討 microRNA- 34c及其靶基因c-Met在原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用。方法熒光定量PCR及Western blot分別檢測(cè)人的肝癌組織及癌旁組織中 microRNA- 34c與c-Met蛋白的表達(dá)、細(xì)胞系HepG2.2.15轉(zhuǎn)染 microRNA- 34c后c-Met mRNA 及蛋白的表達(dá)、細(xì)胞系HepG2.2.15轉(zhuǎn)染microRNA- 34c或c-Met干擾RNA后P53蛋白的表達(dá)。建立裸鼠成瘤模型并進(jìn)行瘤內(nèi)注射治療，測(cè)量計(jì)算腫瘤體積。結(jié)果microRNA- 34c在人的肝癌組織中表達(dá)比癌旁組織明顯降低(P<0.01)，c-Met在肝癌組織中表達(dá)較癌旁組織升高。HepG2.2.15細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染microRNA- 34c后c-Met表達(dá)降低(P<0.01)。HepG2.2.15細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染microRNA- 34c及c-Met干擾RNA后P53表達(dá)升高(P<0.05)。成瘤裸鼠經(jīng)microRNA- 34c質(zhì)粒瘤內(nèi)注射后腫瘤體積較對(duì)照組明顯減小(P<0.05)。結(jié)論microRNA- 34c可能通過(guò)調(diào)節(jié)其靶基因c-Met的表達(dá)抑制原發(fā)性肝癌的發(fā)生和發(fā)展。

原發(fā)性肝癌；微小RNA- 34c；肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體；P53

肝細(xì)胞肝癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，并且是世界上腫瘤相關(guān)的第三大死因[1]。乙肝病毒感染是肝細(xì)胞肝癌發(fā)生的重要原因。由于缺少早期的診斷手段，肝細(xì)胞肝癌的死亡率高，威脅著人類健康[2]。

microRNA是一種由21～25個(gè)核苷酸組成的非編碼微小RNA，microRNA可以通過(guò)與某些mRNAs接合來(lái)影響其翻譯過(guò)程從而發(fā)揮調(diào)節(jié)某些基因的作用[3]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，microRNA可以通過(guò)調(diào)節(jié)其靶基因來(lái)影響腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[4]。其中，microRNAc- 34是一類重要的抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的microRNA家族，其在多種腫瘤組織中表達(dá)下降。microRNAc- 34家族被認(rèn)為是P53的直接調(diào)節(jié)靶點(diǎn)，上調(diào)microRNAc- 34可以導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯[5]。目前，microRNA- 34c有關(guān)的研究相對(duì)較少，有報(bào)道稱，microRNA- 34c與干細(xì)胞肝癌的的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)[6]。本研究探討 microRNA- 34c調(diào)控c-Met在肝細(xì)胞肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

10組臨床標(biāo)本取自在山東省省立醫(yī)院肝膽外科行肝癌切除術(shù)患者。HepG2.2.15細(xì)胞系為山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究所惠贈(zèng)。SPF級(jí)BALB/C-nu/nu裸鼠，雄性，4～6周齡，體質(zhì)量17～20 g[北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號(hào)：SCXK(京)2009- 0004]

1.2 主要試劑

miRNA合成及定量試劑盒(Invitrogen公司)；兔抗人c-Met、P53單克隆抗體(Abcam公司)；抗Tubulin、β-actin鼠單克隆抗體(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔、抗鼠IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；SYBR Green Realtime Pcr Master Mix、cDNA第一鏈合成試劑盒(Toyobo公司)；RNA提取Trizol、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000(Invitrogen公司)；c-Met干擾RNA(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)；microRNA- 34c質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存，實(shí)驗(yàn)PCR引物均由上海華大基因提供。

1.3 方法

1.3.1 熒光定量PCR檢測(cè)臨床組織標(biāo)本中microRNA- 34c的表達(dá)：Trizol法提取肝癌組織及癌旁組織總RNA，按說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng)條件為50 ℃ 2 min, 95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)，U6為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)結(jié)果由2-ΔΔCT公式計(jì)算熒光相對(duì)計(jì)量。

1.3.2 Western blot檢測(cè)臨床組織中c-Met蛋白的表達(dá)：RIPA/PMSF法提取肝癌組織及癌旁組織總蛋白，用BCA試劑盒檢測(cè)所提蛋白濃度后，取40 μg 變性后的蛋白上樣，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，然后電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂牛奶封閉1 h，與c-Met一抗反應(yīng)4 ℃過(guò)夜，TBST洗過(guò)后與山羊抗兔二抗反應(yīng)1 h，TBST洗過(guò)后在伯樂(lè)ChemiDoc XRS+system顯色。

1.3.3 熒光定量PCR及Western blot分別檢測(cè)細(xì)胞系HepG2.2.15轉(zhuǎn)染microRNA- 34c后c-Met mRNA及蛋白的表達(dá)：實(shí)驗(yàn)分為pS-microRNA- 34c組，陰性對(duì)照pS-control組和空白對(duì)照mock組3組。復(fù)蘇細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染前24 h將細(xì)胞以3×105個(gè)/孔接種于6孔板中，每孔加入2 mL DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)每孔加入2 mL optiMEM培養(yǎng)基，10 μL Lipofectamine2000及4 μg microRNA- 34c質(zhì)?；蚩召|(zhì)粒，6 h后換為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，24 h后Trizol法提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總RNA。按說(shuō)明書(shū)合成cDNA，并進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s, 95 ℃ 5 s，55 ℃ 15 s，75 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，GAPDH為內(nèi)參。c-Met上游引物：5′-C AGGCAGTGCAGCATGTAGT-3′，下游引物：5′-GATG ATTCCCTCGGTCAGAA-3′，GAPDH上游引物：5′-AG AAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游引物：5′-AGGGG CCATCCACAGTCTTC-3′。實(shí)驗(yàn)結(jié)果由2-ΔΔCT公式計(jì)算熒光相對(duì)計(jì)量。重復(fù)上述細(xì)胞及轉(zhuǎn)染步驟，轉(zhuǎn)染后48 h提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總蛋白。蛋白的提取及檢測(cè)方法如上所述。

1.3.4 Western blot檢測(cè)細(xì)胞系HepG2.2.15轉(zhuǎn)染microRNA- 34c及c-Met干擾RNA后P53蛋白的表達(dá)：實(shí)驗(yàn)分為microRNA- 34c組，c-Met siRNA組，空白對(duì)照組。c-Met siRNA序列：sense 5′-GCCUGAAU GAUGACAUUCUTT-3′,antisense 5′-AGAAUGUCAUC AUUCAGGCTT-3′。細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染方法如上所述，每孔加入5 μL Lipofectamine2000及100 pmol c-Met siRNA或4 μg microRNA- 34c質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染48 h后提取總蛋白并檢測(cè)，方法如上。

1.3.5 裸鼠肝癌移植腫瘤模型的建立及瘤內(nèi)注射：培養(yǎng)Hepg2.2.15細(xì)胞，胰蛋白酶消化后，PBS稀釋為1×107/mL單細(xì)胞懸液，經(jīng)錐蟲(chóng)藍(lán)檢測(cè)細(xì)胞活性大于95%備用。向裸鼠項(xiàng)背部皮下注射0.2 mL備用細(xì)胞懸液，14 d后形成肝癌移植腫瘤。將成瘤鼠分為3組，每組6只，從成瘤第5天開(kāi)始，每?jī)商旆謩e瘤內(nèi)注射200 μL含pS-microRNA- 34c，pS-control及OPTI-MEM 100 μL的Lipofectamine2000質(zhì)?；鞈乙?，治療14 d后處死成瘤鼠，取移植腫瘤組織測(cè)量，按V=LxI2×0.5公式計(jì)算腫瘤體積，L為腫瘤長(zhǎng)徑，I為腫瘤寬徑。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1肝癌組織中microRNA-34c表達(dá)較癌旁組織明顯下降

10組臨床收集的肝癌組織與癌旁組織比較，9例肝癌組織中microRNA- 34c表達(dá)量分別降低為為相應(yīng)癌旁組織的0.196～0.683倍，1例肝癌組織表達(dá)升高為1.137倍(圖1)。與10例癌旁組織比較，肝癌組織中microRNA- 34c表達(dá)下降(P<0.01)。

圖1 臨床肝癌組織與相應(yīng)癌旁組織中microRNA- 34c的表達(dá)Fig 1 The expression of microRNA- 34c in clinical liver cancer tissues and related normal tissues

2.2 肝癌組織中c-Met表達(dá)較癌旁組織明顯上升

10組肝癌組織與癌旁組織比較，7例肝癌組織中c-Met蛋白表達(dá)升高(圖2)。microRNA靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)及臨床肝癌組織中microRNA- 34c與c-Met表達(dá)量的負(fù)相關(guān)提示，microRNA- 34c可能調(diào)控c-Met的表達(dá)。

2.3Hepg2.2.15細(xì)胞系轉(zhuǎn)染microRNA-34c后c-Met表達(dá)下降

與對(duì)照組比較，microRNA- 34c轉(zhuǎn)染組c-Met在mRNA水平下降為0.356倍(P<0.01)(圖3A)。Mock組蛋白的表達(dá)為0.88±0.01, control組蛋白的表達(dá)為0.84±0.02，microRNA- 34c組蛋白的表達(dá)為0.31±0.01，較mock組及control組明顯減少(P<0.01)(圖3B)。

2.4Hepg2.2.15細(xì)胞系轉(zhuǎn)染microRNA-34c,c-Met干擾RNA后P53表達(dá)升高

Mock組蛋白的表達(dá)為0.27±0.01，microRNA- 34c轉(zhuǎn)染組蛋白表達(dá)為0.69±0.02，c-Met干擾RNA轉(zhuǎn)染組蛋白表達(dá)為0.63±0.02，與mock組比較，microRNA- 34c及c-Met干擾RNA組P53表達(dá)均增高(P<0.05)(圖4)。

2.5 microRNA- 34c在體內(nèi)抑制肝癌的生長(zhǎng)

裸鼠成瘤及瘤內(nèi)注射14 d后，pS-microRNA- 34c組移植腫瘤體積為289±36 mm3，顯著低于pS-control組和OPTI-MEM組的674±49 mm3和698±57 mm3(P<0.05)(圖5)。

3 討論

肝細(xì)胞肝癌是最長(zhǎng)見(jiàn)的惡性腫瘤之一，與其他腫瘤相比，肝細(xì)胞肝癌死亡率在世界范圍內(nèi)位居第三，而在中國(guó)位居第二，其五年生存率不足5%[7]。目前，肝細(xì)胞肝癌的診療手段還十分有限，而分子靶向治療是當(dāng)前肝細(xì)胞肝癌領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。microRNA作為一種自身產(chǎn)生的非編碼微小RNA，可以通過(guò)調(diào)控其靶基因參與細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡等病理生理過(guò)程[8]。microRNAc- 34家族可能在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了抑癌基因的作用，這也提示著microRNAc- 34家族可能作為分子靶向治療的重要部分為肝細(xì)胞肝癌的診療帶來(lái)幫助[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中microRNA- 34c在表達(dá)明顯下降，其預(yù)測(cè)靶基因c-Met表達(dá)增多，二者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，microRNA- 34c可抑制c-Met的表達(dá)。前期研究表明，c-Met過(guò)表達(dá)會(huì)持續(xù)激活肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子HGF/c-Met通路，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[10- 11]。最新研究表明，抑癌基因P53可以調(diào)控microRNAc- 34的表達(dá)[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，肝癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)microRNA- 34c及干擾c-Met表達(dá)均可增加P53的表達(dá)量。目前，microRNA動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究比較少，本研究通過(guò)裸鼠成瘤模型的建立和瘤內(nèi)注射后腫瘤體積的測(cè)量發(fā)現(xiàn)，microRNA- 34c在一定程度上可以抑制體內(nèi)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。綜上所述，microRNA- 34c在肝癌組織中表達(dá)下調(diào)，在肝癌細(xì)胞中抑制c-Met的表達(dá)并且增加P53的表達(dá)。同時(shí)，microRNA- 34c可在小鼠體內(nèi)抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)。本研究為microRNAc- 34作為未來(lái)分子靶向治療的可能提供了一定的理論依據(jù)。以后的工作中，可以進(jìn)一步探討microRNA- 34c調(diào)節(jié)c-Met對(duì)原發(fā)性肝癌侵襲及轉(zhuǎn)移機(jī)制的影響，明確microRNA- 34c在原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

圖2 臨床肝癌組織與相應(yīng)癌旁組織中c-Met蛋白的表達(dá)Fig 2 The expression of c-Met protin in clinical liver cancer tissues and related normal tissues

*P<0.01 compared with control圖3 Hepg2.2.15細(xì)胞系轉(zhuǎn)染microRNA- 34c后c-Met的表達(dá)量Fig 3 The expression of c-Met in Hepg2.2.15 cell lines tansfected with microRNA- 34c plasmid

圖4 microRNA- 34c質(zhì)粒及c-Met干擾RNA轉(zhuǎn)染Hepg2.2.15細(xì)胞系后P53的表達(dá)Fig 4 The expression of P53 in Hepg2.2.15 cell lines transfected with microRNA- 34c plasmid or c-Met siRNA respectively

圖5 瘤內(nèi)注射后3組移植腫瘤體積大小的比較Fig 5 Comparion of transplanted tumor size after intratumor injection

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microRNA- 34c suppressesdevelopment of hepatocellular carcinoma by downregulating c-Met

YU Xiao-jian，WANG Yan，LI Rui-feng，LI Li，LIU Yu-gang*

(Dept. of Pathophysiology，School of Medicine，Shandong University，Jinan 250012，China)

ObjectiveTo study the effect of microRNA- 34c on the development of hepatocellular carcinoma.MethodsExpressions of microRNA- 34c and c-Met protein in clinical hepatocellular carcinoma tissue and para-carcinoma tissue, c-Met mRNA and protein in HepG2.2.15 cells transfected with microRNA- 34c, P53 protein in HepG2.2.15 cells transfected with microRNA- 34c or c-Met siRNA were detected by qPCR and Western blot respectively. Xenograft nude mice with liver cancer was established and the volume of tumors was measured.ResultsMicroRNA- 34c expression was significantly decreased in the hepatocellular carcinoma tissue compared with para-carcinoma tissue(P<0.01),while the c-Met expression was inverse.MicroRNA- 34c can inbit c-Met expression in HepG2.2.15 cells(P<0.01).Downregulation of c-Met ehanced P53 activity(P<0.05).MicroRNA- 34c inhibited the growth of liver cancer in xenograft nude mice modle(P<0.05).ConclusionsMicroRNA- 34c may play a role in suppressing the development of hepatocellular carcinoma by downregulating c-Met.

hepatocellular carcinoma；microRNA- 34c；c-Met；P53

2014- 01- 13

2014- 03- 28

*通信作者(correspondingauthor)：liuyugang@sdu.edu.cn

1001-6325(2014)09-1250-05

R 575.1

A