施鳴銘，楊祖立，朱曉芳，鄭雅娟，張世馥

(浙江理工大學 生命科學學院 蛋白質組學與分子酶學實驗室, 浙江 杭州 310018)

研究論文

P38-2G4蛋白在紅系細胞分化過程中的動態(tài)表達分析

施鳴銘，楊祖立，朱曉芳，鄭雅娟，張世馥*

(浙江理工大學 生命科學學院 蛋白質組學與分子酶學實驗室, 浙江 杭州 310018)

目的分析小鼠P38-2G4蛋白在紅系細胞分化中的表達及功能，初步研究該蛋白是否參與紅系分化過程。方法制備E10.5～E16.5胎肝細胞、FVA細胞及誘導劑丁酸鈉和六亞甲基二乙酰胺誘導不同時間的小鼠紅白血病細胞MEL，用Western blot檢測P38-2G4蛋白在上述3種細胞中的表達，同時以聯(lián)苯胺染色法檢測細胞分化的標志蛋白血紅蛋白的表達。結果在不同分化期的胎肝細胞中，P38-2G4蛋白的表達先升高后降低；在FVA細胞分化過程中，P38-2G4表達量同樣先增加后減少；而在誘導劑誘導MEL細胞分化過程中，P38-2G4表達量呈下降趨勢。結論P38-2G4蛋白在不同紅系分化組織中的差異性表達提示該蛋白參與了小鼠紅系細胞的分化過程。

P38-2G4；胎肝；FVA細胞；誘導分化；紅系分化

小鼠P38-2G4蛋白屬增殖相關蛋白家族(proliferation-associated protein 2G4, PA2G4)，是細胞周期特異性調節(jié)的DNA結合蛋白[1]，目前對其研究較少。肝臟是胚胎時期主要的造血器官，小鼠E12～E15[2]和人胚胎6周至4月是胎肝造血活躍期。小鼠尾靜脈注射小鼠致貧血病毒(anemia-inducing strain of Friend virus, FVA)后，其脾臟中紅系細胞發(fā)育被同步阻滯在原紅細胞時期，稱為FVA細胞[3]。該細胞在體外促紅細胞生成素(erythropoietin, EPO)存在培養(yǎng)下可進入終末分化。小鼠紅白血病細胞(mouse erythroleukemia, MEL)在多種誘導劑作用下可發(fā)生惡性逆轉并向正常方向分化。

本研究前期發(fā)現P38-2G4蛋白在胎肝紅系分化過程中存在差異性表達，推測其參與小鼠紅系分化過程。本實驗擬通過胎肝細胞、FVA細胞及誘導分化細胞中P38-2G4蛋白的表達，探索其是否參與紅系細胞分化過程，為進一步研究P38-2G4在紅系分化過程中的作用奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 動物和細胞

MEL、K562和HL-60細胞(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞中心)。小鼠致貧血病毒FVA(ATCC)。清潔級，6～8周齡，體質量25 g左右的ICR(Institute of Cancer Research)小鼠和20 g左右的BALB/C小鼠[杭州師范大學實驗動物中心，SCXK(浙2011-0048)]。

1.2 試劑

六甲基雙乙酰胺(HMBA，Sigma公司)，丁酸鈉(SB，Sigma公司)，IMDM培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(FBS，Hyclone公司)，促紅細胞生成素(EPO，R&D公司)，α-硫代甘油(Sigma公司)，L-谷氨酰胺(Sigma公司)，牛血清白蛋白(BSA，Sigma公司)，聯(lián)苯胺(中國遠航試劑公司)，兔抗小鼠P38-2G4抗體(Abcam公司，ab33613)，羊抗兔IgG單克隆抗體(Earthox公司)，Western bright ECL底物發(fā)光試劑盒(Advansta公司)。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)及細胞樣品的制備：MEL細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃，5% CO2飽和濕度下培養(yǎng)，第2～3天傳代1次，取對數增殖期細胞用于實驗。收集細胞，1 000r/min離心10 min，棄上清，PBS洗3次，1×107細胞加入1 mL細胞裂解液，置冰上30 min。4 ℃，12 000r/min，離心30 min，取上清備用。HL-60，K562細胞同樣處理。

1.3.2 小鼠組織樣品的制備：ICR小鼠頸椎脫臼處死，取小鼠骨髓、腦、胃、小腸、腎、肺、脾、肝和心臟等組織，用D-Hank’s緩沖液沖洗3次，剪碎后放入微量勻漿器中，按0.1 kg/L加入細胞裂解液，置冰上30 min，4 ℃，12 000r/min，離心45 min，收集上清，備用。

1.3.3 胎肝樣品的制備：懷孕E10.5～E16.5 ICR小鼠頸椎脫臼處死，分離胎肝組織于D-Hank’s緩沖液中。制成單細胞懸液，D-Hank’s緩沖液洗2次，室溫25 ℃，1 000r/min，離心10 min，重懸于D-Hank’s緩沖液中。

1.3.4 FVA細胞的分離和培養(yǎng)：給BALB/C小鼠尾靜脈注射病毒10～14 d左右，頸椎脫臼處死，取脾臟制成單細胞懸液，D-Hank’s緩沖液洗2次，室溫，1 000r/min，離心10 min，重懸于含30% 胎牛血清，0.1% 牛血清白蛋白，10-4mol/L α-硫代甘油，2 mmol/L谷氨酰胺的IMDM培養(yǎng)基中。錐蟲藍染色計數，FVA細胞按1×109/L接種于培養(yǎng)瓶中，實驗組加入200 IU/L EPO，37 ℃，5% CO2飽和濕度下培養(yǎng)。

1.3.5 細胞的誘導分化：取對數增殖期MEL細胞以3×107/L濃度接種于細胞瓶，加入丁酸鈉(1.25 mmol/L)或六甲基雙乙酰胺(3 mmol/L)誘導細胞。同時設置不加藥的對照組，分別培養(yǎng)1～5 d。

1.3.6 聯(lián)苯胺染色檢測血紅蛋白：分別收集培養(yǎng)1～5 d的實驗組和對照組細胞，室溫，1 000r/min，離心3 min；棄上清，0.85 %氯化鈉溶液洗1次，加入預混的聯(lián)苯胺染液(30% H2O2:0.04%聯(lián)苯胺染液1∶40, v∶v)，滴片鏡檢、拍照。

1.3.7 Western blot檢測P38-2G4表達：收集各組樣品，提取細胞總蛋白，采用Bradford法進行蛋白濃度測定。取適量總蛋白，用12%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進行蛋白電泳，將蛋白樣品轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。分別加入抗小鼠P38-2G4多克隆抗體(1∶20 000)和抗小鼠β-actin(1∶10 000)，4 ℃孵育過夜，洗滌緩沖液TBST洗膜后加入羊抗兔(1∶20 000)二抗(含辣根過氧化物酶標記)，37 ℃孵育2 h，TBST洗膜后化學發(fā)光法進行顯色反應。對條帶進行灰度掃描，以目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值比值計算不同樣品的目的蛋白表達量差異。

2 結果

2.1 P38-2G4蛋白的小鼠組織表達譜

取小鼠的腦、胃、小腸、腎、肺、脾、肝和心等組織，檢測P38-2G4在小鼠組織中的表達(圖1)。

圖1 P38-2G4蛋白在小鼠組織表達Fig 1 P38-2G4 expresses in different tissues of mouse

2.2P38-2G4蛋白在不同白血病細胞及正常造血細胞中的表達

收集K562、MEL、HL-60腫瘤細胞樣品，小鼠骨髓為正常造血細胞樣品，進行Western blot(圖2)。K562、HL-60、MEL細胞中P38-2G4的表達量分別是骨髓細胞的3.39、2.65和2.33倍。

圖2 P38-2G4蛋白在白血病細胞和骨髓細胞中的表達Fig 2 P38-2G4 expresses in leukemia cells and marrow cells

2.3不同發(fā)育期的胎肝中P38-2G4蛋白的差異性表達

A.the benzidine staining of fetal liver cells in different days; B.the expression of P38-2G4 from E10.5 to E16.5; 1.E10.5 fetal liver; 2.E13.5 fetal liver; 3.E16.5 fetal liver, it shows karyopyknosis and enucleation(×600)圖3 不同發(fā)育期胎肝細胞的聯(lián)苯胺染色與Westernblot檢測P38-2G4蛋白表達結果Fig 3 The benzidine staining and Western blot result of fetal liver cells at different development stages

對小鼠E10.5，E13.5，E14.5胎肝進行聯(lián)苯胺染色，胎肝中的紅系祖細胞出現體積縮小，細胞核固縮，排核等分化特征(圖3A)。取E10.5～E16.5的胎肝總蛋白進行Western blot，檢測P38-2G4蛋白在不同發(fā)育期的胎肝中的表達情況(圖3B)。

2.4FVA細胞紅系分化時P38-2G4蛋白的表達差異

在200 IU/L EPO條件下培養(yǎng)FVA細胞，出現紅系終末分化特征，如細胞體積減小，細胞核減小，核固縮等(圖4A)。Western blot檢測發(fā)現P38-2G4蛋白在FVA細胞中的表達也存在差異性(圖4B)。

A.the benzidine staining of FVA cell differentiating induced by EPO; B.the expression of P38-2G4 during differentiation; 1.the 2nd hour of FVA cells induced by EPO, it shows karyopyknosis; 2.the 12th hour of FVA cells induced by EPO; 3.the 24th hour of FVA cells induced by EPO, it shows enucleation; 4.the 36th hour of FVA cells induced by EPO(×600)圖4 EPO誘導FVA細胞分化過程的聯(lián)苯胺染色和Western blot檢測P38-2G4蛋白表達結果Fig 4 The benzidine staining and Western blot result of FVA cells induced by EPO

2.5誘導分化細胞中P38-2G4蛋白的差異性表達

利用丁酸鈉(sodium butyrate，SB)和六亞甲基二乙酰胺(N,N′-Hexamethylenebisacetamide，HMBA)誘導MEL細胞向紅系方向分化。SB可有效誘導MEL細胞向紅系方向發(fā)生定向分化，合成血紅蛋白，且核質比減小(圖5A)。而在SB誘導MEL分化過程中，P38-2G4蛋白表達量呈逐漸遞減趨勢，120 h細胞P38-2G4表達量為0 h細胞的0.41倍(圖5B)。同樣， 用HMBA誘導MEL向紅系方向分化，Western blot檢測分化過程中P38-2G4的表達，結果也呈逐漸遞減趨勢(圖5C)。

A.the benzidine staining of MEL induced by SB; B.the expression of P38-2G4 during differentiation induced by SB; C.the expression of P38-2G4 during differentiation induced by HMBA; 1.the 72th hour of MEL; 2.the 96th hour of MEL; 3.the 72th hour of MEL induced by SB; 4.the 96th hour of MEL induced by SB(×200)

圖5誘導劑誘導MEL分化過程的聯(lián)苯胺染色和Westernblot檢測P38-2G4蛋白表達結果
Fig5ThebenzidinestainingandWesternblotresultofMELinducedbyinducer

3 討論

P38-2G4是一種DNA結合蛋白，屬增殖相關蛋白家族，目前對其功能尚不十分清楚。本實驗前期利用雙向凝膠電泳-質譜分析胎肝紅系分化過程時發(fā)現P38-2G4蛋白存在差異性表達，由此推測該蛋白可能參與紅系分化過程。

結果顯示，P38-2G4蛋白在小鼠腦、胃、小腸、腎、肺、肝和心臟等組織中差異性表達，且在肝組織中表達量最高，提示該蛋白可能與造血功能相關；而在K562、HL-60、MEL 3種白血病細胞中，P38-2G4蛋白表達量高于骨髓細胞2～3倍，這表明P38-2G4在正常組織和腫瘤細胞中具有不同功能，并且與細胞的癌變相關。

胎肝細胞的聯(lián)苯胺染色及形態(tài)學觀察結果顯示，E10.5細胞已有血紅蛋白生成，細胞逐漸發(fā)生核固縮，并出現排核現象。Western blot結果顯示，P38-2G4蛋白從E10.5開始增加，E14.5達到E10.5的2.28倍，至E15.5開始下降(圖3B)。小鼠胎肝E12到E15為造血活躍期[2]，而P38-2G4蛋白的高表達正處于該時期，因此說明P38-2G4參與胎肝細胞的紅系分化過程。

FVA細胞聯(lián)苯胺染色結果顯示，在EPO存在條件下，FVA細胞向紅系方向分化，開始表達血紅蛋白，細胞核發(fā)生固縮、偏位。Western blot結果顯示，P38-2G4蛋白在2 h(原幼紅細胞)和12 h(早幼紅細胞)的表達量是0 h的1.21倍和1.11倍，隨后開始下降(圖4B)，這種差異性表達說明P38-2G4參與了FVA細胞的紅系分化過程。

SB作為一種去乙?；敢种苿?，能夠提高組蛋白乙酰化水平，誘導MEL細胞向紅系方向分化。HMBA通過使細胞阻滯于G1期，抑制細胞增殖，誘導細胞分化[4]。本文利用兩種誘導劑分別誘導MEL細胞分化，結果顯示兩種藥物誘導過程中，P38-2G4蛋白的表達量均被下調，且SB誘導過程中下調趨勢更明顯(圖5B,C)。這表明，P38-2G4蛋白確實參與了紅系分化過程。

據報道，Ebp1是一種人類增殖相關蛋白，與小鼠P38-2G4蛋白同源，兩者結構相似，僅存在4個氨基酸殘基差異。Ebp1具有p42和p48兩種亞型，有不同的組織和功能特異性[5]，可通過促進或抑制細胞增殖參與多種細胞的分化過程[6- 9]。因此推測，P38-2G4蛋白可能同樣通過增殖參與紅系細胞的分化。

綜上所述，P38-2G4蛋白在正常組織和癌變細胞中具有不同的功能，且參與多種紅系分化過程，但具體機制任有待深入研究。

[1] Nakagawa Y, Watanabe S, Akiyama K,etal. Cdna cloning, sequence analysis and expression of a mouse 44-kda nuclear protein copurified with DNA repair factors for acid-depurinated DNA[J]. Acta Medi Okayama, 1997, 51: 195- 206.

[2] Morrison S J, Hemmati H D, Wandycz A M,etal. The purification and characterization of fetal liver hematopoietic stem cells[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1995, 92: 10302- 10306.

[3] Koury M, Sawyer S, Bondurant M. Splenic erythroblasts in anemia‐inducing friend disease: A source of cells for studies of erythropoietin‐mediated differentiation[J]. J Cell Physiol, 1984, 121: 526- 532.

[4] 王欽紅, 范華驊, 陳勤奮等. 六亞甲基二乙酰胺體外誘導HL-60 細胞分化的機制[J]. 復旦學報:醫(yī)學版, 2004, 1- 4.

[5] Squatrito M, Mancino M, Donzelli M,etal. Ebp1 is a nucleolar growth-regulating protein that is part of pre-ribosomal ribonucleoprotein complexes[J]. Oncogene, 2004, 23: 4454- 4465.

[6] Lessor T J, Yoo J Y, Xia X,etal. Ectopic expression of the erbb-3 binding protein ebp1 inhibits growth and induces differentiation of human breast cancer cell lines[J]. J Cell Physiol, 2000, 183: 321- 329.

[7] Ishimaru D, Ramalingam S, Sengupta T K,etal. Regulation of bcl-2 expression by hur in hl60 leukemia cells and a431 carcinoma cells[J]. Mol Cancer Res: MCR, 2009, 7: 1354- 1366.

[8] Kim C K, Nguyen T L, Joo K M,etal. Negative regulation of p53 by the long isoform of erbb3 binding protein ebp1 in brain tumors[J]. Cancer Res, 2010, 70: 9730- 9741.

[9] Oh S M, Liu Z, Okada M,etal. Ebp1 sumoylation, regulated by tls/fus e3 ligase, is required for its anti-proliferative activity[J]. Oncogene, 2010, 29: 1017- 1030.

Analysis of dynamic expression of P38-2G4 during erythroid cells differentiation

SHI Ming-ming, YANG Zu-li, ZHU Xiao-fang, ZHENG Ya-juan, ZHANG Shi-fu*

(Lab of Proteomics and Molecular Enzymology, College of Life Science, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China)

ObjectiveAnalysis of the expression and function of mouse P38-2G4 protein in the differentiation of erythroid cells, and to find whethere P38-2G4 is involved in the differentiation of erythroid.MethodsThe expressions of P38-2G4 in fetal liver from E10.5 to E16.5, FVA cells and MEL cells induced by SB and HMBA were detected by Western bolt. The hemoglobin as a marker protein of erythroid cell differentiation was detected by benzidine staining.ResultsThe expression of P38-2G4 in fetal liver cells of different differentiating stages increased at first and then decreased; the expression of P38-2G4 during FVA cells differentiating had a same trend; but decreased during inducing.ConclusionsDifferential expression of P38-2G4 in different erythroid differentiation shows that P38-2G4 is involved in mouse erythroid differentiation.

：P38-2G4; Fetal liver; FVA cell; inducing differentiation; erythroid differentiation

2013- 01- 15

2014- 03- 24

*通信作者(correspondingauthor)：cklzhan@163.com

1001-6325(2014)09-1245-05

Q 291

A