蔡齊超 侯玉澤 鄧瑞廣 胡驍飛 王 耀 張小帆 王方雨

(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，洛陽(yáng) 471003)

黃曲霉毒素M1(Aflatoxin M1，AFM1)是目前發(fā)現(xiàn)最穩(wěn)定的一種真菌毒素，具有二呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)，在365 nm的紫外線(xiàn)下可發(fā)出藍(lán)紫色的熒光［1，2］。AFM1的毒性很大，是氰化鉀的5倍，砒霜的40倍［3，4］。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)也一再提升AFM1的致癌等級(jí)，已從1993年的二類(lèi)致癌物質(zhì)提升為2002年的一類(lèi)致癌物［2，5］。由于黃曲霉毒素M1大多見(jiàn)于嬰幼兒奶粉及其他乳制品中，而且目前缺乏行之有效的防治措施和去毒方法，因此世界各國(guó)均制定了嚴(yán)格的毒素殘留標(biāo)準(zhǔn)［6，7］。中國(guó)和俄羅斯要求在乳及乳制品中，黃曲霉毒素M1的最高限量為0.5 μg/kg;而日本和歐盟的要求更高，其最高限量為0.05 μg/kg［8］。目前檢測(cè) AFM1 殘留的方法很多，主要包括薄層層析法(TLC)、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS)和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等［9-15］。由于TLC只能定性不能定量，而且所需時(shí)間長(zhǎng);HPLC操作復(fù)雜，儀器昂貴，并且對(duì)檢測(cè)樣品性質(zhì)要求較高，所以它們都不適于現(xiàn)場(chǎng)大規(guī)模的檢測(cè)。而免疫學(xué)快速檢測(cè)方法因其特異性高、敏感性好、快速簡(jiǎn)便、對(duì)樣品要求低等優(yōu)點(diǎn)，在小分子抗原檢測(cè)中具有非常廣闊的前景?？贵w是免疫學(xué)檢測(cè)不可或缺的生物性原材料，人工抗原是抗體制備的前提，因此，成功合成AFM1人工抗原就顯得尤為重要，這為AFM1單克隆抗體制備及AFM1免疫學(xué)快速檢測(cè)試劑的研制奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 溶液 溶液PBS(Phosphate buffered saline，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液)，洗液 PBST(PBS∶Tween20=2×103∶1)，包被液 CBS(Carbonate buffered saline，0.05 mol/L NaHCO3/Na2CO3緩沖液)，封閉液(PBST∶豬血清=20∶1)，TMD 底物緩沖液，終止液(2 mol/L H2SO4)。

1.1.2 試劑 黃曲霉毒素 M1(Aflatoxin M1，AFM1)，Sigma產(chǎn)品，純度≥98.0%;1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)，Thermo scientific公司產(chǎn)品;BSA和 OVA，弗氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant，F(xiàn)CA)和弗氏不完全佐劑(Freund’s incomplete adjuvant，F(xiàn)IA)，Pierce 產(chǎn)品;羊抗兔酶標(biāo)二抗(GaRIgG-HRP)，華美生物工程有限公司;試驗(yàn)用雙蒸水(ddw)由本實(shí)驗(yàn)室制備;其他所用試劑均為市售AR(分析純)級(jí)。

1.1.3 儀器 U-3000紫外掃描儀(UV)，日本島津公司;3K-18高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司;Bio-Rad-550型酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Rad公司;HI9321酸度計(jì)，美國(guó) HANNA公司;AE260電子天平，德國(guó)METTLER公司;ZF-7三用紫外分析儀，鞏義予華儀器有限責(zé)任公司;XMTD-8222電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司;JM-250電泳儀，大連捷邁科貿(mào)有限公司;超純水儀，Millipore產(chǎn)品。

1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物 購(gòu)自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的6周齡雌性BALB/c小鼠，均為SPF級(jí)，由河南省動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 人工抗原的合成

1.2.1.1 AFM1肟(AFM1O)的制備 將2 mg的AFM1和4 mg的氨氧基乙酸半鹽酸鹽(CMO)溶于2 ml吡啶甲醇水的混合液中(吡啶∶甲醇∶雙蒸水=1∶4∶1)，控溫(120℃)回流，薄層色譜法監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。待反應(yīng)完全，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑旋干，加入2 ml ddw溶解，用2 mol/L的H2SO4調(diào)節(jié)pH=4，再用5 ml乙酸乙酯萃取2～3次，合并有機(jī)相，并用 ddw洗滌2次，再次旋干液體，得到的黃色油狀物質(zhì)即是AFM1O。

1.2.1.2 完全抗原的制備 AFM1-BSA的制備:用0.4 ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解 AFM1O，取0.2 ml再加入0.3 ml ddw配成N，N-二甲基甲酰胺和水(DMF∶H2O=2∶3)的混合溶液，加入 1 mg EDC，室溫避光活化4 h后，再補(bǔ)加1 mg EDC，此為A液。稱(chēng)3.35 mg BSA，用0.13 mol/L的 NaHCO3溶液(2.76 ml)制成10%BSA活化溶液，此為B液。將B液逐滴加入到A液中，避光攪拌24 h。在4℃下用PBS攪拌透析3 d，每天換液4次，離心去沉淀獲得純化的AFM1-BSA［16，17］。AFM1O-OVA 的 制備:方法同上，用 OVA(2.13 mg)取代 BSA，得到AFM1O-OVA，反應(yīng)方程如圖1。

1.2.2 薄層層析法鑒定 將肟化物用少量二甲基甲酰胺(DMF)溶解，以10 ml氯仿和甲醇的混合液(氯仿∶甲醇=9∶1)為展開(kāi)劑，用鉛筆在硅膠板上畫(huà)兩道線(xiàn)，用毛細(xì)管在一條線(xiàn)上點(diǎn)樣，插入盛有展開(kāi)劑的容器中，點(diǎn)樣線(xiàn)在下但高于液面。在展開(kāi)劑層析到另一條線(xiàn)時(shí)，取出硅膠板，在暗室中，用365 nm的紫外分析儀照射，觀察并記錄亮斑反應(yīng)方程如圖2。

1.2.3 紫外掃描鑒定 用PBS配制AFM1、BSA和OVA標(biāo)準(zhǔn)溶液，調(diào)節(jié)合成抗原的濃度與標(biāo)準(zhǔn)溶液相一致，用紫外掃描儀測(cè)定，在波長(zhǎng)220～440 nm范圍內(nèi)得到最大吸收峰及特征值。

1.2.4 SDS-PAGE凝膠電泳鑒定 按照文獻(xiàn)［18］介紹的方法配制所需電泳溶液。基于所分離蛋白比較單一，且分子量相當(dāng)大，選擇電泳條件:濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為12%，濃縮膠電壓90 V，分離膠電壓100 V，上樣量為20 μl，考馬斯亮藍(lán)染色4 h后，置脫色液中脫色，為加快進(jìn)程，可更換2～3次脫色液。

1.2.5 免疫學(xué)方法(ELISA)鑒定

1.2.5.1 動(dòng)物免疫 取高壓PBS溶解AFM1-BSA至50 μg/ml，與等量弗氏完全佐劑(首免用完全佐劑，之后用不完全佐劑)混合，用乳化器充分乳化后，免疫小鼠。小鼠背部皮下6點(diǎn)注射，免疫劑量為0.2 ml/只，共免4次，免疫間隔為21 d。三免后10 d 斷尾采血 10 μl至 990 μl PBS 中，4 000 r/min 離心取上清，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5.2 包被板的制備 首先，AFM1-OVA包被，包被濃度和包被量分別為 5 μg/ml和 50 μl/孔，37℃溫育2 h，PBST洗板5次;然后，用5%豬血清封閉220 μl/孔，37℃溫育1 h，PBST 洗5 次，晾干后4℃保存。

1.2.5.3 多抗血清(pAb)效價(jià)測(cè)定 采用間接ELISA方法測(cè)定多抗血清效價(jià)。第一步，用5%豬血清鋪底50 μl/孔，在第一行加小鼠血清 50 μl/孔，倍比稀釋到倒數(shù)第二行，設(shè)陰性對(duì)照(NC，即用未免疫AFM1-BSA的小鼠血清)和空白對(duì)照(BC)，37℃溫育15 min，洗5次;第二步，加GaMIgG-HRP，用5%豬血清1∶1 000 倍稀釋?zhuān)?0 μl/孔，37 ℃溫育 30 min，洗 6次;第三步，加TMB顯色50 μl/孔，室溫反應(yīng)10 min;第四步，加 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng) 50 μl/孔，讀OD450;第五步，結(jié)果判斷:以待測(cè)孔 OD450值≥NC OD450值的2.1 倍(P/N≥2.1)，判為陽(yáng)性［19］。

1.2.5.4 多抗血清(pAb)抑制價(jià)測(cè)定 采用阻斷ELISA鑒定pAb抑制價(jià)。方法與1.2.5.3基本相同，只是第一步略有不同，改為用5%豬血清鋪底50 μl/孔，加 OD450為 1.0左右的小鼠血清50 μl和不同濃度的 AFM1標(biāo)準(zhǔn)品作抑制劑，設(shè)NC和 BC，37℃溫育15 min，PBST洗5次。最后計(jì)算抑制率(B/B0，B0為 AFM1濃度為0時(shí)的OD450，B為不同濃度 AFM1的 OD450)。以 B/B0為縱坐標(biāo)，以AFM1濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制抑制曲線(xiàn)，根據(jù)曲線(xiàn)趨勢(shì)推導(dǎo)回歸方程，計(jì)算小鼠多抗血清對(duì)AFM1的50%抑制濃度(IC50)，以 IC50衡量其敏感度［20］。

2 結(jié)果

2.1 TLC鑒定肟化物 由圖3可知，遷移距離較遠(yuǎn)的是 AFM1標(biāo)準(zhǔn)品，遷移距離較近的為肟化物AFM1O。AFM1與CMO的反應(yīng)完全時(shí)間很難確定，但是TLC能夠確定肟化反應(yīng)的進(jìn)程，所以采用TLC可以確定AFM1與CMO反應(yīng)完全的時(shí)間。在查閱的文獻(xiàn)中，回流反應(yīng)的時(shí)間有很多，有回流2 h、2.5 h、3.5 h、4 h和5 h。本實(shí)驗(yàn)用TLC確定反應(yīng)進(jìn)程，自回流2 h后開(kāi)始檢測(cè)。圖3A是還未開(kāi)始反應(yīng)時(shí)的TLC檢測(cè)，點(diǎn)樣AFM1標(biāo)品和混合液。圖3B是在肟化反應(yīng)2 h時(shí)TLC檢測(cè)，點(diǎn)樣AFM1標(biāo)品和混合液。圖3C是肟化反應(yīng)2.5 h時(shí)TLC檢測(cè)，點(diǎn)樣AFM1標(biāo)品和混合液。

2.2 UV鑒定人工抗原 用U-3000紫外掃描儀對(duì)AFM1、BSA、AFM1-BSA 在 220～440 nm 波長(zhǎng)范圍進(jìn)行掃描。由圖4可看到BSA在280nm處有吸收峰，AFM1在262 nm處有吸收峰，而偶聯(lián)物AFM1-BSA在274 nm處出現(xiàn)最大吸收峰，與BSA和AFM1的最大吸收峰均不重合，證明偶聯(lián)成功。

圖1 AFM1O的制備Fig.1 Preparation of AFM1O

圖2 AFM1人工抗原和檢測(cè)抗原的制備Fig.2 Preparation of AFM1 artificial antigen and coated antigen

2.3 SDS-PAGE鑒定人工抗原 由圖5可知，AFM1-BSA的泳動(dòng)速度小于BSA，而且有較明顯的擴(kuò)散現(xiàn)象，說(shuō)明BSA的分子量小于AFM1-BSA，證明AFM1與BSA偶聯(lián)成功。

2.4 ELISA鑒定人工抗原

2.4.1 ELISA測(cè)定pAb效價(jià) 由表1可知，免疫的3只小鼠血清抗體效價(jià)均達(dá)到了1×10－4，其中1號(hào)小鼠最高，達(dá)到1∶1.28×104，說(shuō)明用 AFM1-BSA 免疫小鼠能夠獲得較好的免疫效果。

2.4.2 阻斷ELISA測(cè)定pAb敏感性 選取抑制最好的3號(hào)小鼠做標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線(xiàn)。由圖6可知，3號(hào)小鼠的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線(xiàn)的線(xiàn)性回歸方程為y=－0.246 5x+1.130 1，相關(guān)系數(shù) R2=0.970 4，IC50=359.9 ng/ml，表明3號(hào)小鼠的血清對(duì)AFM1具有較高的敏感性。說(shuō)明免疫抗原和檢測(cè)抗原均偶聯(lián)成功。

表1 3只小鼠pAb間接ELISA效價(jià)測(cè)定結(jié)果Tab.1 Titers of polyclonal antibodies of three BALB/c mice detected by indirect ELISA

圖3 AFM1和AFM1O的薄層色譜圖Fig.3 TLC of AFM1 and AFM1-BSA

圖4 BSA、AFM1和AFM1-BSA的紫外掃描光譜Fig.4 UV scanning spectrum of BSA，AFM1 and AFM1-BSA

圖5 AFM1-BSA偶聯(lián)物的SDS-PAGE鑒定Fig.5 Identification of AFM1-BSA conjugation by SDSPAGE

圖6 阻斷ELISA檢測(cè)3號(hào)小鼠AFM1 IC50Fig.6 IC50inhibitive curve of mice 3 AFM1 polyclonal antiserum by competitive ELISA

3 討論

3.1 AFM1抗原偶聯(lián)方法 AFM1是小分子物質(zhì)，屬于半抗原，即只有反應(yīng)原性，無(wú)免疫原性，因此只有將其與具有免疫性的大分子載體蛋白偶聯(lián)后，才能形成完全抗原。由于AFM1分子構(gòu)象中并沒(méi)含有羧基等易與載體蛋白相結(jié)合的基團(tuán)，故本實(shí)驗(yàn)采用肟化法在AFM1分子構(gòu)象上添加一個(gè)羧基，以便接下來(lái)用碳化二亞胺法(EDC)分別制備出免疫抗原和檢測(cè)抗原。

3.2 TLC確定肟化完全 本文采用TLC法來(lái)確定肟化反應(yīng)的進(jìn)程。AFM1和CMO回流反應(yīng)，反應(yīng)完全時(shí)間很難確定。本實(shí)驗(yàn)將AFM1和CMO在雙頭燒瓶進(jìn)行回流，這可方便取液檢測(cè)。TLC確定反應(yīng)進(jìn)程，自回流2 h后開(kāi)始檢測(cè)，每隔0.5 h TLC檢測(cè)，在2.5 h時(shí)已經(jīng)完全反應(yīng)。用TLC確定了反應(yīng)物完全肟化，不僅縮短了試驗(yàn)時(shí)間，提高了效率，而且還減少了加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)引起的許多副反應(yīng)的發(fā)生。

3.3 AFM1偶聯(lián)物的鑒定 鑒定免疫抗原和檢測(cè)抗原的方法一般有紫外掃描光譜法、SDS-PAGE電泳法和 ELISA法。通過(guò)紫外掃描，可知偶聯(lián)物AFM1-BSA和AFM1-OVA的最大特征吸收峰與BSA、OVA的最大吸收峰及AFM1的最大吸收峰均不重合，證明AFM1-BSA和AFM1-OVA合成成功。因?yàn)锳FM1-BSA和AFM1-OVA與BSA和OVA的分子質(zhì)量不同，采用SDS-PAGE凝膠電泳跑蛋白膠，它們的泳動(dòng)速率也會(huì)不同，AFM1-BSA和BSA、AFM1-OVA和OVA能明顯錯(cuò)開(kāi)，所以證明AFM1-BSA和AFM1-OVA合成成功。ELISA法是將制備的免疫原免疫小鼠，均獲得良好效價(jià)，做敏感性實(shí)驗(yàn)時(shí)，3號(hào)小鼠的IC50達(dá)到了359.9 ng/ml，這也證明小分子AFM1偶聯(lián)載體蛋白成功。

本實(shí)驗(yàn)合成并鑒定了AFM1的人工抗原，獲得敏感性好、特異性強(qiáng)的多克隆抗體，為進(jìn)一步篩選AFM1單克隆抗體和研制AFM1快速檢測(cè)試劑盒或試紙條打下了良好的基礎(chǔ)。

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