姚添淇 吳瑩瑩 楊小猛 匡渤海 劉志剛(深圳大學過敏反應與免疫學研究所，深圳518060)

過敏性哮喘(Bronchial asthma)是以肺部多種細胞特別是肥大細胞、嗜酸性粒細胞和T淋巴細胞等浸潤和對各種激發(fā)因子產(chǎn)生氣道高反應為特征的慢性氣道炎癥疾病，在易感者中此種炎癥可引起反復發(fā)作的氣促、喘息、咳嗽和胸悶等癥狀，氣道對多種刺激因子反應性增高，其發(fā)病率有逐年上升的趨勢［1，2］。過敏性哮喘的發(fā)生和過敏原的接觸密切相關，粉塵螨變應原是誘導哮喘和其他變態(tài)反應疾病最重要的變應原之一［3，4］。有研究表明哮喘與過敏性鼻炎患者血清中粉塵螨抗原特異性IgE抗體陽性率為70%～80%［5］。肥大細胞在病理學中扮演了非常重要的角色，特別是過敏或內(nèi)源性的哮喘。在過敏反應中，肥大細胞是連接過敏反應致敏階段與效應階段的樞紐細胞，粉塵螨抗原特異性IgE與肥大細胞表面受體FcεRI結合從而活化肥大細胞，肥大細胞的活化釋放了大量的生物活性介質(zhì)包括組織胺、蛋白酶、半胱氨酰白三烯和前列腺素等，肥大細胞脫顆粒為檢測肥大細胞是否被活化提供了重要依據(jù)［6］。鑒于種種現(xiàn)狀，對肥大細胞在過敏性哮喘中的病理學作用的研究有著非常重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料 粉塵螨粗抗原由深圳大學過敏和免疫研究所提供，BALB/c小鼠購自廣州實驗動物中心，明礬佐劑購自Thermo公司，色甘酸鈉購自Sigma公司，辣根過氧化物酶(Streptavidin-HRP)、生物素標記的羊抗鼠IgE抗體購自Southernbiotect公司，TMB顯色液購自湖州英創(chuàng)生物科技有限公司，γ干擾素(IFN-γ)、白細胞介素4(IL-4)和白細胞介素10(IL-10)ELISA檢測試劑盒購自美國eBioscience公司，組胺檢測試劑盒購自武漢優(yōu)爾生生物公司。

1.2 動物免疫與處理 30只BALB/c小鼠隨機均分為3組，陰性對照組(A組)、哮喘模型組(B組)和治療組(C組)。A組始終使用PBS處理，B組和C 組在第0、7和14天用50 μg粉塵螨粗抗原+50 μl明礬佐劑腹腔注射致敏。在第28天，A組和B組用PBS、C組用粉塵螨粗抗原(350 μg/次)皮下注射免疫1周，隔天免疫1次，末次免疫1周后開始用50 μg粉塵螨粗抗原滴鼻激發(fā)，每天1次，連續(xù)7次。末次激發(fā)24 h后進行氣道高反應檢測。末次激發(fā)48 h后處死小鼠，取血，分離制備血清－20℃保存;對小鼠進行肺泡灌洗收集肺泡灌洗液(BALF)，收集的BALF離心后吸取上清－20℃保存，沉淀細胞用PBS洗2次后定容至1 ml體積待染色;無菌摘取肺組織和脾臟，分別進行肺組織病理切片與脾細胞培養(yǎng)。

1.3 方法

1.3.1 氣道高反應的檢測 小鼠在第7次激發(fā)24 h之后，對小鼠進行氣道高反應性(AHR)變化的檢測。首先將小鼠罩入非創(chuàng)傷性全體積呼吸計量器(Whole body plethysmograph)鼠籠中，小鼠依次吸入霧化后的 PBS 緩沖液與 6.25、12.5、25、50 和 100 mg/ml的乙酰甲膽堿，觀察小鼠肺功能指標擴大間隙(Penh)值的變化，并以正常狀態(tài)下小鼠為基礎值，繪制不同乙酰甲膽堿濃度激發(fā)下Penh值變化的百分比曲線。

1.3.2 BALF中細胞總數(shù)、嗜酸粒細胞計數(shù) 各組BALF離心后獲得的沉淀細胞，用PBS清洗2次，定容為1 ml的細胞懸液，充分混勻后吸取0.01 ml在顯微鏡下進行細胞計數(shù)。取0.2 ml/個進行甩片，分別用劉氏染色液和甲苯胺藍染色液對甩片進行染色，在光學顯微鏡下進行細胞計數(shù)和分類，觀察肥大細胞脫顆?，F(xiàn)象。

1.3.3 肺組織學觀察 打開小鼠胸腔，無菌摘取各組小鼠支氣管肺組織，分別用4%多聚甲醛溶液和Bouin固定液固定，經(jīng)過脫水包埋后常規(guī)石蠟切片，分別進行HE染色和甲苯胺藍染色，光學顯微鏡觀察肺部炎癥細胞浸潤程度和肥大細胞脫顆粒狀況，參照文獻［7］的Underwood評分法記錄評分。

1.3.4 小鼠血清中特異性IgE水平測定 使用封閉液(pH9.6)稀釋粉塵螨粗抗原至終濃度10 μg/ml，加入96孔板中4℃封閉過夜。用含有5%胎牛血清的PBS按1∶100稀釋度稀釋免疫血清，然后加入到已包被粉塵螨粗抗原的96孔板中，100 μl/孔，37℃孵育2 h;PBST(含吐溫-20)洗板5次，加入100 μl生物素標記的羊抗鼠IgE抗體37℃孵育2 h，PBST洗板5次;加入辣根過氧化物酶(Streptavidin-HRP)100 μl/孔，37℃孵育 2 h;PBST(含吐溫-20)洗板5 次，然后加入 3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色液顯色，終止反應后在酶標儀上讀取吸光度A450值。

1.3.5 脾臟制備脾細胞懸液和脾細胞體外培養(yǎng)用RPMI1640培養(yǎng)基將脾細胞懸液的細胞密度稀釋至 5.0×106ml－1。將 100 μl脾細胞懸液加入無菌平底24孔板中，按照每個樣本在有或無粉塵螨粗抗原(終濃度20 μg/ml)的條件下，在37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72 h后收集培養(yǎng)上清液。

1.3.6 BALF和脾細胞體外培養(yǎng)上清細胞因子IL-4、IL-10和IFN-γ的測定 按ELISA試劑盒說明書操作分別測定其IL-4、IL-10和IFN-γ水平。

1.3.7 BALF和血清中組胺水平的測定 按ELISA試劑盒說明書操作分別測定各組的組胺水平。

2 結果

2.1 氣道高反應檢測結果 結果顯示(圖1)，A組與B組相比，在25、50和100 mg/ml的乙酰甲膽堿濃度激發(fā)時，兩組數(shù)據(jù)差異顯著，兩者間的差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。與 B組相比，C組在12.25 mg/ml的乙酰甲膽堿濃度激發(fā)時與之持平，但在25、50和100 mg/ml的乙酰甲膽堿濃度激發(fā)時走勢與A組相似，B組與C組兩者間有顯著差異(P＜0.01)。

2.2 BALF中細胞計數(shù) 計數(shù)結果顯示，和A組［(4.23±1.18) ×104ml－1，0］相比，B 組(模型組)BALF 中的細胞總數(shù)［(77.61±8.45)×104ml－1］和嗜酸粒細胞數(shù)［(18.53±5.12)×104ml－1］明顯增多。與 B 組相比，C 組［(34.22±6.61)×104ml－1，(2.25±0.66)×104ml－1］BALF 中細胞總數(shù)和嗜酸粒細胞數(shù)顯著減少(P＜0.01)。BALF中嗜酸粒細胞數(shù)之間的差異有統(tǒng)計學意義。圖2和圖3所示為B組和C組BALF中細胞甩片進行劉氏染色和甲苯胺藍染色后的結果。

2.3 小鼠肺部炎癥觀察 肺組織HE病理切片顯示，B組氣管管壁出現(xiàn)明顯增厚、輕度糜爛、絨毛損傷、排列紊亂等現(xiàn)象，并呈現(xiàn)以嗜酸性粒細胞為主的炎癥細胞浸潤現(xiàn)象，表明粉塵螨粗抗原引起了B組小鼠出現(xiàn)肺部病變;C組中氣管管壁完整排列基本整齊無明顯損傷，炎癥細胞浸潤癥狀減弱;見圖4。肺組織甲苯胺藍病理切片顯示，B組肥大細胞膜出現(xiàn)不規(guī)則不完整狀，肥大細胞有空洞基本無顆粒，氣管壁周圍有明顯的顆粒狀物質(zhì)存在，表明肥大細胞已出現(xiàn)脫顆粒，肥大細胞被激活;C組中肥大細胞細胞膜趨于完整，顆粒被抑制在肥大細胞中未釋放，氣管壁周圍并無明顯顆粒存在;見圖5、6。

圖1 乙酰甲膽堿吸入后各組Penh值變化(n=10)Fig.1 Assessment of airway hyper-responsiveness follo wing inhaled methacholine(n=10)

圖2 BALF中細胞甩片劉氏染色后的結果(×400)Fig.2 Histopathologic changes of BALF spun cells by Liu's staining(×400)

圖3 BALF中細胞甩片甲苯胺藍染色后的結果(×400)Fig.3 Histopathologic changes of BALF spun cells by Toluidine blue staining(×400)

圖4 小鼠肺組織切片HE染色(×400)Fig.4 Histopathologic changes of mice lungs by HE stain(×400)

圖7 小鼠血清中特異性IgE水平檢測Fig.7 Assessment of special-IgE of mice serum

圖8 BALF和脾細胞體外培養(yǎng)上清細胞因子IL-4、IL-10和IFN-γ水平檢測Fig.8 Assessment of IL-4，IL-10 and IFN-γ of BALF and supernatants of splenocytes

圖9 BALF和血清中組胺水平檢測Fig.9 Assessment of histamine of BALF and serum

2.4 小鼠血清中特異性IgE水平 與B組相比，C組小鼠血清中特異性IgE抗體水平明顯降低(P＜0.01);見圖7。

2.5 BALF和脾細胞體外培養(yǎng)上清細胞因子IL-4、IL-10和IFN-γ水平 結果顯示，與B組相比，C組BALF中IL-4水平明顯降低接近A組值(P＜0.01)，而IL-10與A、B兩組相比有明顯升高(P＜0.01)，C組的IFN-γ 高于A、B兩組(P＜0.01)。C 組脾細胞上清中IL-4明顯低于B組(P＜0.01)，而IL-10明顯高于B組(P＜0.01)，IFN-γ也明顯高于 B組(P＜0.01)，見圖 8。

2.6 BALF和血清中組胺水平 結果顯示，在BALF中，C組與B組相比略低(P＜0.05)，而在血清中檢測出的組胺有明顯降低(P＜0.05)，見圖9。

3 討論

本實驗參照國內(nèi)外文獻，利用腹腔內(nèi)注射塵螨抗原(塵螨粗提液)致敏，同時給予佐劑明礬，采用滴鼻激發(fā)的方法，成功建立了塵螨過敏性哮喘模型。本實驗制作的小鼠過敏性哮喘模型具有哮喘的基本特征［8］:具有氣道的炎癥及氣道高反應性，小鼠的BALF中的細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞均明顯增多，部分肺組織也可見炎癥細胞的浸潤。血清中抗原特異性IgE水平明顯升高。對BALF中IL-4和IFN-γ的測定表明:IL-4明顯升高，而IFN-γ明顯降低，表現(xiàn)為Th2型的細胞因子占優(yōu)勢。用塵螨粗提液進行治療后，小鼠的哮喘癥狀明顯減輕，表現(xiàn)為:氣道高反應性和肺部病理癥狀減輕，細胞總數(shù)和嗜酸粒細胞數(shù)明顯減少，血清中抗原特異性IgE抗體水平明顯降低，BALF和脾細胞體外培養(yǎng)上清細胞因子IL-4水平治療組明顯降低接近陰性對照組值，而IL-10治療組與其他兩組相比有明顯升高，治療組的IFN-γ也高于其他兩組。這說明利用塵螨粗提液對于哮喘的治療是非常有效果的，能夠大大減輕哮喘癥狀。

組織內(nèi)的肥大細胞來源于骨髓、臍帶血的干細胞。體外培養(yǎng)CD34+造血干細胞，在IL-3的作用下，可產(chǎn)生肥大細胞;而IL-4和其他的基質(zhì)蛋白則影響肥大細胞的成熟。哺乳類動物組織內(nèi)的肥大細胞主要分布于機體與外界環(huán)境相通的地方，如皮膚、氣道和消化道，這些部位經(jīng)?？梢越佑|到病原體、過敏原以及環(huán)境中的其他物質(zhì)。肥大細胞在這些物質(zhì)的刺激下，脫顆粒、釋放胞漿遞質(zhì)，如組胺、白細胞介素、蛋白酶和前列腺素等［9，10］。其中，組胺作為一種前炎癥因子，僅存在于肥大細胞和嗜堿性粒細胞中，只有這些細胞被激活脫顆粒時，其才能釋放到細胞外發(fā)揮作用。因此，組胺被認為是肥大細胞脫顆粒的標志物。目前，許多抗過敏藥物均具有抑制IgE誘導的肥大細胞釋放組胺的作用［11］。通過組胺釋放實驗，本實驗中治療組BALF和血清中的組胺水平都有降低，因此可推斷出治療組中肥大細胞的脫顆粒能力降低，這與模型組小鼠過敏性哮喘癥狀的減輕密切相關。

通過小鼠過敏性哮喘模型及利用塵螨粗提液對過敏性哮喘小鼠的治療，本實驗探討了肥大細胞與過敏性哮喘之間的關系，有利于人們對于過敏性哮喘病因機理的了解，為利用抗組胺藥物治療過敏性哮喘提供了理論依據(jù)。

［1］Brozek JL，Bousquet J，Baena-Cagnani CE，et al.Allergic rhinitis and its impact on asthma(ARIA)guidelines:2010 revision［J］.J Allergy Clin Immunol，2010，126(3):466-476.

［2］Bousquet J，Mantzouranis E，Cruz AA，et al.Uniform definition of asthma severity，control，and exacerbations:Document presented for the world health organization consultation on severe asthma［J］.J Allergy Clin Immunol，2010，126(5):926-938.

［3］Sade K，Roitman D，Kivity S.Sensitization to Dermatophagoides，Blomia tropicalis，and other mites in atopic patients ［J］.J Asthma，2010，47(8):849-852.

［4］陳育智，馬 煜，王紅玉，等.中國三城市兒童個人過敏原與喘息及氣道高反應性的相關性研究［J］.中華兒科雜志，2003，41(7):538-541.

［5］朱健琪，劉志剛，高 波，等.粉塵螨I類變應原(Der f I)的克隆表達、純化及免疫學特性［J］.昆蟲學報，2006，49(2):213-218.

［6］Wenzel SE，Larsen GL，Johnston K，et al.Elevated levels of leukotriene C4 in bronchoalveolarlavage fluid from atopic asthmatics after endobronchial allergen challenge［J］.Am Rev Respir Dis，1990，142:112e 9.

［7］Yu HQ，Li XH，Guo H，et al.Sublingual immunotherapy efficacy of Dermatophagoides farinae vaccine in a murine asthma model［J］.Int Arch Allergy Immunol，2010，152(1):41-48.

［8］郝敏麒，徐 軍，鐘南山.塵螨致敏小鼠肺部變應性炎癥模型的建立［J］.中國病理生理雜志，2003，19(1):139-141.

［9］沈士亮.肥大細胞與過敏性哮喘［J］.皖南醫(yī)學院學報，2012，31(5):345-348.

［10］鄭敬民，尹 廣，姚根宏，等.肥大細胞在糖尿病腎病患者腎組織中的分布及相關性研究［J］.醫(yī)學研究生學報，2012，25(6):622-627.

［11］謝 華，何韶衡，程明華，等.類胰蛋白酶抑制劑對人大腸肥大細胞組胺釋放的影響［J］.細胞與分子免疫學雜志，2004，20(6):678-681.