薛慶節(jié) 趙 強(qiáng) 司傳平 陳 廷(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)免疫學(xué)省級(jí)重點(diǎn)學(xué)科，濟(jì)寧 272013)

EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)屬皰疹病毒科γ病毒亞科，是重要的DNA病毒，能夠?qū)е氯祟?lèi)腫瘤。大多EB病毒第一次感染人后沒(méi)有明顯的癥狀，但是人一旦感染，將終身攜帶該病毒。在以后的生活中由于環(huán)境等因素的影響一旦病毒被活化，就可能引起腫瘤。研究發(fā)現(xiàn)，EB病毒與許多人類(lèi)惡性腫瘤相關(guān)，包括胃癌、霍奇金淋巴瘤、Burkitt's淋巴瘤、鼻咽癌(NPC)等［1，2］。本研究擬將前期實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建成功的GM-CSF和EB病毒LMP2A融合基因腺病毒載體vAd-GC2A，進(jìn)行免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，檢測(cè)融合基因GC2A的表達(dá)及功能，為協(xié)同殺傷EBV陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 腺病毒pAdTrack-CMV與pAdEasy-1購(gòu)自北京普如汀生物有限公司;QBI-293A細(xì)胞為本室保存，EB病毒陽(yáng)性胃癌細(xì)胞GT39由青島大學(xué)羅兵教授饋贈(zèng)，乳酸脫氫酶底物溶液(Roche公司)、非放射性CTL殺傷活性檢測(cè)試劑盒、DNA連接酶、DNA聚合酶購(gòu)于 Promega生物公司，EcoR I、DNA Marker、BamH I、Sal I為博亞產(chǎn)品;T4DNA 連接酶、Taq酶及各種限制性?xún)?nèi)切酶為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品;乳酸脫氫酶試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品;淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自Pharmacia公司;GM-CSF、IL-2、IL-4購(gòu)自Sigma公司;GM-CSF及LMP2A抗體購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 方法 重組腺病毒融合基因(被命名為vAd-GC2A)的構(gòu)建和包裝方法見(jiàn)文獻(xiàn)［3］。

1.2.1 反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)重組腺病毒GC2A基因的表達(dá) 以vAd-GC2A感染EB病毒陽(yáng)性293細(xì)胞，4 d后收集所培養(yǎng)細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min(離心半徑10 cm，溫度4℃)去上清液，提取細(xì)胞總RNA，所獲產(chǎn)物加入DNasel消化處理后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR。LMP2A引物設(shè)計(jì)如下:LMP2A上游引物F6:5'-GGAGATCTATGGGGTCCCTAGAAATGGTG-3'，下游引物F4:5'-GCGATATCTACAGTGTTGCGATATGGGGT-3'，電泳鑒定結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物為1 545 bp。取6 μl細(xì)胞離心后的上清作模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)(用EBV陽(yáng)性人胃癌細(xì)胞GT39作對(duì)照)，反應(yīng)條件同文獻(xiàn)［4］，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)。

1.2.2 重組腺病毒感染EBV陽(yáng)性胃癌細(xì)胞 將150 μl EBV陽(yáng)性胃癌細(xì)胞GT39懸液(約5×103個(gè))置于96孔板中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，待細(xì)胞貼壁后接種相同滴度的病毒，試驗(yàn)設(shè)vAd-GC2A及未感染組，每組設(shè)4個(gè)平行，分別于接種病毒 0、24、48、72、96 和120 h時(shí)，于熒光顯微鏡下檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)重組腺病毒GC2A基因表達(dá)(1)樣品制備:vAd-GC2A感染EBV陽(yáng)性人胃癌細(xì)胞GT39，37℃吸附培養(yǎng)1 h后，補(bǔ)足培養(yǎng)液，4 d后收獲細(xì)胞，加2 ml裂解液，37℃、－80℃反復(fù)凍融4次，4℃12 000 r/min(離心半徑10 cm)離心5 min，收集上清液(蛋白)。(2)處理后的蛋白進(jìn)行8%SDS-PAGE電泳，然后取出凝膠，測(cè)大小后在轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡1 h。準(zhǔn)備PVDF膜，各邊可略大于凝膠1～2 mm。將膜浮于去離子水中約10 min，并將6張濾紙?jiān)谵D(zhuǎn)移緩沖液中浸泡備用。在陽(yáng)極上先后疊放3張濾紙、一張PVDF膜、電泳凝膠及3張濾紙。將陰極放夾層上，根據(jù)凝膠面積按0.65 mA/cm2通電。完成后取凝膠，用考馬斯亮藍(lán)染色，檢查蛋白轉(zhuǎn)移情況。(3)將膜放入塑料盒中，加封閉液，室溫下在搖床上慢慢搖動(dòng)1～2 h，加入用封閉液1∶15稀釋的 GM-CSF抗體(或 LMP2A抗體)，4℃輕搖2.5 h。棄去液體，用PBS洗膜3次，每次10 min。將膜移至 300 ml緩沖液［150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)］，室溫下輕輕振蕩 15 min。加入HRP標(biāo)記的第二抗(用封閉液，不含疊氮鈉，1∶500稀釋)，室溫輕輕振蕩1.5 h。將膜放入350 ml緩沖液中，于室溫下輕輕振蕩，溫育10 min，重復(fù)4次。將A液和B液各500 μl(ECL顯色系統(tǒng))混勻加至PVDF膜上，1.5 min后中止。用保鮮膜封好后，暗室內(nèi)加X(jué)-光片曝光70 s。

1.2.4 LMP2A重組抗原免疫小鼠并檢測(cè)外周血中抗體水平 將5周齡BALB/c雌性鼠隨機(jī)分4組，每組10只，分2個(gè)免疫組，2個(gè)對(duì)照組:空腺病毒對(duì)照組和PBS組。用LMP2A重組抗原皮內(nèi)注射免疫小鼠，每周1次，共3次。第1組:每只注射重組腺病毒5×108病毒顆粒/(100 μl/只);第2組:每只小鼠注射重組腺病毒5×107病毒顆粒/(100 μl/只);第3組:每小鼠注射未插入外源片段的腺病毒1×108病毒顆粒/(100 μl/只);第 4 組: 則注射 100 μl無(wú)菌PBS。免疫3次，間隔3周。免疫前、免疫后、加強(qiáng)免疫后每2周對(duì)小鼠尾部采血1次，至免疫后第21周止。采集外周血，分離、提取血清，用ELISA方法測(cè)抗體。包被抗原是本室制備的LMP2A重組抗原，2 μg/ml。96孔酶標(biāo)板每孔0.5 μg LMP2A重組抗原孵育封閉，然后加鼠血清樣品(不同稀釋度)反應(yīng)，與羊抗鼠 IgG抗體、羊抗鼠IgG2a抗體或羊抗鼠IgG1抗體孵育后，加底物四甲基聯(lián)苯胺(3，3p，5，5p-Tetramethy lbenzidine，TMB)，2 mol/L硫酸溶液終止反應(yīng)后用 Thermo Multiskan MK3酶標(biāo)儀檢測(cè)。

1.2.5 小鼠脾淋巴細(xì)胞CTL活性測(cè)定 分離小鼠脾淋巴細(xì)胞，用含3 μg/ml的 ConA、20 U/ml IL-2 的10%小牛血清RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)2 d，MOI為1 000的重組腺病毒在500 μl RPMI1640中37℃感染120 min。將小鼠脾淋巴細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞并用培養(yǎng)基洗2次，去除殘存病毒，皮下注射免疫6～8周小鼠，野毒株及PBS作對(duì)照。第3和第5周各加強(qiáng)免疫1次，共免疫3次。第7周后處死取小鼠，取出脾臟，分離淋巴細(xì)胞，取培養(yǎng)24 h的各孔上清液100 μl，按照試劑盒所示方法用乳酸脫氫酶釋放法檢測(cè)各孔光密度值(A450值)，計(jì)算CTL對(duì)EBV陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的殺傷率。

2 結(jié)果

2.1 GM-CSF和EB病毒LMP2A融合基因PCR產(chǎn)物的電泳分析結(jié)果 提取感染細(xì)胞總RNA，DNase l消化處理可能污染的DNA，RT-PCR檢測(cè)GC2A融合基因的轉(zhuǎn)錄;同時(shí)以未感染重組腺病毒的CNE細(xì)胞RNA為模板作為對(duì)照，瓊脂糖電泳分析可觀察到約為1 961 bp大小的擴(kuò)增片段，對(duì)照為陰性，表明融合基因在陽(yáng)性胃癌細(xì)胞能有效轉(zhuǎn)錄(圖1)。

圖1 重組腺病毒的RT-PCR鑒定Fig.1 Identification ofrecombinantadenovirusby RT-PCR

2.2 EBV陽(yáng)性胃癌細(xì)胞中重組腺病毒的表達(dá)用重組腺病毒感染EBV陽(yáng)性胃癌細(xì)胞，重組腺病毒攜帶2個(gè)獨(dú)立的CMV啟動(dòng)子表達(dá)盒，分別表達(dá)目的基因GC2A和GFP;48 h后在熒光顯微鏡下觀察到EBV陽(yáng)性胃癌細(xì)胞中GFP熒光，而對(duì)照胃癌細(xì)胞無(wú)熒光，可間接反映目的基因表達(dá)(圖2)。

圖2 48 h腺病毒感染后的EBV陽(yáng)性胃癌細(xì)胞(×200)Fig.2 48 h EBV positive gastric cancer cells after adenovirus infection(×200)

2.3 感染vAd-GC2A的EBV陽(yáng)性胃癌細(xì)胞GMCSF抗體和LMP2A基因的表達(dá) 從感染vAd-GC2A的EBV陽(yáng)性胃癌細(xì)胞制備蛋白樣品，經(jīng)SDS-PAGE電泳和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示GM-CSF和LMP2A表達(dá)陽(yáng)性，見(jiàn)圖3。

2.4 重組腺病毒免疫小鼠外周血中抗體水平分析用1×108和5×107pfu重組腺病毒分別免疫小鼠，用ELISA方法檢測(cè)在外周血中抗體水平及變化。如圖4所示，當(dāng)免疫抗原劑量低時(shí)，產(chǎn)生抗體量比較少，用高劑量重組腺病毒免疫時(shí)，抗體量增長(zhǎng)比較快，抗體水平比較高。具體為，免疫前1周抽血，抗體滴度接近于0，免疫后1周抽血，最大劑量的抗體滴度為(64.8±8.4)pg/ml，次要?jiǎng)┝繛?55.5±8.2)pg/ml，對(duì)照野毒株及PBS對(duì)照株接近于0，隨著免疫時(shí)間的延長(zhǎng)，重組腺病毒刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體增長(zhǎng)較快，至免疫后第6周，最大劑量的抗體滴度達(dá)(184.5±8.7)pg/ml，次要?jiǎng)┝繛?126±7.2)pg/ml，免疫后第7周抗體量不再增長(zhǎng)，而2對(duì)照組不增長(zhǎng)。最大劑量及次要?jiǎng)┝颗c對(duì)照野毒株和對(duì)照PBS相比，其差異具有顯著性(P≤0.05)，而最大劑量與次要?jiǎng)┝恐g的差異無(wú)顯著性。

2.5 重組腺病毒免疫對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞CTL活性的影響 本研究分重組腺病毒實(shí)驗(yàn)組、腺病毒5型野毒株及PBS對(duì)照組，每組6只小鼠。通過(guò)免疫小鼠，收集小鼠脾臟，分離脾細(xì)胞，用乳酸脫氫酶法檢測(cè)結(jié)果顯示，重組腺病毒免疫小鼠的CTL活性明顯高于腺病毒和PBS免疫組，提示重組vAd-GC2A病毒感染小鼠的淋巴細(xì)胞，在小鼠體內(nèi)起到呈遞抗原的作用，并有效激發(fā)CTL反應(yīng)(圖5)。

乳酸脫氫酶釋放法檢測(cè)各孔光密度(A450)并計(jì)算平均值結(jié)果見(jiàn)表1，利用公式計(jì)算CTL對(duì)EBV陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的殺傷率并統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表明，重組腺病毒對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞CTL有明顯的激活作用。不同刺激物誘導(dǎo)的CTL對(duì)EBV陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的殺傷率，重組腺病毒實(shí)驗(yàn)組為(66.7±6.9)%，而腺病毒5型野毒株和PBS分別為(24.3±2.5)%和(32.4±3.1)%。其差異具有顯著性(P≤0.05)。

圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)GC2A基因的表達(dá)Fig.3 Detection of GC2A gene expression by Western blot

圖4 重組腺病毒免疫小鼠后外周血中抗體水平觀察Fig.4 Observation the level of antibody in peripheral blood of mice immunized with recombinant adenovirus

圖5 重組腺病毒疫苗對(duì)脾淋巴細(xì)胞CTL活性影響Fig.5 Effect of recombinant adenovirus vaccine to spleen lymphocyte CTL activity

表1 乳酸脫氫酶釋放法檢測(cè)各孔光密度(A450)平均值Tab.1 Averageoptical density of lactate dehydrogenase release assay(A450)

3 討論

EB病毒與很多腫瘤密切相關(guān)，其中大細(xì)胞淋巴瘤是免疫缺陷病人常發(fā)生的一種主要腫瘤。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，用免疫方法來(lái)預(yù)防癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移以及作為預(yù)防治療技術(shù)的有益補(bǔ)充，得到越來(lái)越多醫(yī)療工作者的重視［4］。GM-CSF(Gramulocyte/macrophase colony-stimulating factor，GM-CSF)由144aa組成、大小約為22 kD，其對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DC)調(diào)節(jié)作用非常強(qiáng)，能促進(jìn)DC增殖與分化，維持DC細(xì)胞活力，并且對(duì)DC分布和抗原提呈有調(diào)節(jié)作用。將GM-CSF轉(zhuǎn)移至腫瘤細(xì)胞可極大增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性，提高人體抗腫瘤反應(yīng)［5，6］。研究證實(shí)，在瘤體內(nèi)注射能夠表達(dá)GM-CSF基因的重組腺病毒可有效地誘導(dǎo)人體抗腫瘤免疫反應(yīng)，增強(qiáng)抗腫瘤免疫的效果［7］。LMP2A基因編碼的產(chǎn)物是一個(gè)很好的引發(fā)CTL反應(yīng)的蛋白，國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者都在致力于由LMP2A引發(fā)的CTL來(lái)治療EB病毒陽(yáng)性腫瘤。LMP2A為EBV的表面潛伏膜蛋白基因，可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體［8，9］。Redchenko 等［10］用 LMP2A表位多肽負(fù)載DC，誘導(dǎo)出大量的特異性CTL，因此，LMP2A可成為EBV相關(guān)腫瘤免疫治療的理想靶抗原。如將LMP2A基因聯(lián)合轉(zhuǎn)入腺病毒表達(dá)載體，則可能表達(dá)兩種抗原，使機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫，預(yù)防和治療EB病毒感染及殺傷EB病毒陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞。

腺病毒具有宿主廣、易感染分裂期、靜止期及終末分化期細(xì)胞的特點(diǎn);用作基因工程的、能復(fù)制的缺陷腺病毒除具有上述特點(diǎn)之外，還具有很好的安全性［11］。向腺病毒中導(dǎo)入表達(dá)抗原的基因，被認(rèn)為是一種很好的腫瘤疫苗發(fā)展策略。目前已有不少成功的先例［12］，這些研究結(jié)果顯示，重組腺病毒能夠引發(fā)強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫，對(duì)腫瘤有一定的抑制作用。本研究結(jié)果表明，將基因GM-CSF和LMP2A進(jìn)行融合，在體外構(gòu)建重組腺病毒表達(dá)載體，可充分發(fā)揮LMP2A誘導(dǎo)特異性CTL的產(chǎn)生［13］和GM-CSF的免疫增強(qiáng)作用，進(jìn)而協(xié)同殺傷EBV陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞。

將融合基因GC2A作為外源性基因構(gòu)建重組腺病毒載體后，用重組腺病毒轉(zhuǎn)染EBV陽(yáng)性的上皮性腫瘤細(xì)胞系，進(jìn)一步深入研究融合基因GC2A通過(guò)聯(lián)合激發(fā)機(jī)體免疫，共同殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制，為開(kāi)展基因防治與治療奠定基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)免疫抗原劑量低時(shí)，產(chǎn)生抗體量比較少，用高劑量重組腺病毒免疫時(shí)，抗體量增長(zhǎng)比較快，抗體水平比較高。另外，重組vAd-GC2A病毒感染小鼠的淋巴細(xì)胞后，在小鼠體內(nèi)起到呈遞抗原的作用，并有效激發(fā)CTL反應(yīng)。為進(jìn)一步應(yīng)用vAd-GC2A治療或預(yù)防EB病毒相關(guān)腫瘤奠定了理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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