宋楊英 張建軍 陳 穎 單保恩 劉英姿(河北省玉田縣醫(yī)院檢驗(yàn)科，玉田 064100)

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤。由于其惡性程度高、侵襲性強(qiáng)、復(fù)發(fā)率高，常規(guī)手術(shù)、放化療效果均不佳。免疫治療成為一種治療膠質(zhì)瘤的新方法。多種免疫刺激劑已經(jīng)應(yīng)用到了膠質(zhì)瘤的免疫治療中［1］，以增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤作用，比如IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IFN-γ、IL-12［2，3］。機(jī)體通過(guò)免疫監(jiān)視功能識(shí)別、殺傷并清除體內(nèi)突變細(xì)胞，防止腫瘤的發(fā)生。膠質(zhì)瘤細(xì)胞能夠逃逸機(jī)體免疫監(jiān)視功能與其本身特有的免疫學(xué)特征密不可分。①膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面MHC類分子表達(dá)低，細(xì)胞免疫原性弱，導(dǎo)致T細(xì)胞抗腫瘤活性下降［4，5］。②膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面共刺激分子和黏附分子表達(dá)降低［6］，腫瘤抗原呈遞不足。③膠質(zhì)瘤細(xì)胞分泌多種免疫抑制因子［7］，影響腫瘤微環(huán)境，使腫瘤局部淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)減少，影響T細(xì)胞的免疫反應(yīng)［8，9］。因此若能夠上調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面MHC類分子和(或)CD80、CD86的表達(dá)，將對(duì)提高機(jī)體免疫功能、抑制膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)，起到至關(guān)重要的作用。

IL-18是一種多效性細(xì)胞因子，由于其能夠誘導(dǎo)IFN-γ產(chǎn)生，增強(qiáng)Th1型反應(yīng)，誘導(dǎo)Th1/Th2細(xì)胞分化，增強(qiáng)NK活性，調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫等多種生物學(xué)功能，已被證實(shí)有很強(qiáng)的抗腫瘤作用［10，11］。因此，本研究擬通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)探討外源性IL-18基因轉(zhuǎn)染對(duì)大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面分子表達(dá)的影響，為IL-18應(yīng)用于膠質(zhì)瘤的臨床治療奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和動(dòng)物 9L/IL-18、9L/LXSN及9L細(xì)胞由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心構(gòu)建并保存;5～6周齡，雄性Fischer344大鼠(F344大鼠)購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(合格證號(hào):0191929)。

1.1.2 試劑和儀器

1.1.2.1 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco/BRL公司;胎牛血清(FCS)購(gòu)自杭州四季青公司;PE標(biāo)記抗大鼠CD80抗體、FITC標(biāo)記抗大鼠CD86抗體、APC標(biāo)記抗大鼠MHCⅠ類分子抗體、FITC標(biāo)記抗大鼠MHCⅡ類分子抗體購(gòu)自eBioscience公司。

1.1.2.2 主要儀器 流式細(xì)胞分析儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 方法

1.2.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面MHCⅠ類分子、MHCⅡ類分子及共刺激分子CD80、CD86的表達(dá)收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期9L/IL-18、9L/LXSN、9L細(xì)胞各兩瓶，分別用PBS洗細(xì)胞1 000 r/min×5 min×2次，0.25%胰酶消化后將細(xì)胞分別收集于流式小管中，PBS洗1 000 r/min×5 min×2次，分別加入PE標(biāo)記抗大鼠CD80抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記抗大鼠CD86抗體，APC標(biāo)記抗大鼠MHCⅠ抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記抗大鼠MHCⅡ抗體，常溫避光作用30 min，PBS洗1 000 r/min×5 min×2次后，流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)。

1.2.2 建立大鼠腦膠質(zhì)瘤模型

1.2.2.1 細(xì)胞準(zhǔn)備 ①收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期9L/IL-18、9L/LXSN及9L細(xì)胞，PBS將細(xì)胞稀釋為濃度1×108ml－1細(xì)胞懸液各1.0 ml，吹打混勻后將細(xì)胞懸液移入1.5ml Eppendorf(EP)管，置于冰上待接種。②分別取10 μl 9L/IL-18、9L/LXSN 及9L 細(xì)胞懸液，PBS稀釋10倍，加入臺(tái)盼藍(lán)染液，混勻后各取10 μl于細(xì)胞計(jì)數(shù)板下觀察，死細(xì)胞被染成藍(lán)色，活細(xì)胞圓形透明，不被染色。計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算活細(xì)胞比例。三種細(xì)胞內(nèi)活細(xì)胞比例均＞95%。

1.2.2.2 立體定向技術(shù)建立大鼠腦膠質(zhì)瘤模型①將5～6周齡雄性F344大鼠隨機(jī)分成3組，每組5只。②接種方法:2%戊巴比妥鈉注射液將F344大鼠腹腔注射麻醉后，固定于大鼠腦立體定向儀上。頭部部分去毛常規(guī)消毒后沿頭正中線縱向切開(kāi)頭皮，暴露出前囪部位。用牙科鉆在前囪中點(diǎn)前1.0 mm，矢狀縫右3.0 mm處鉆一骨孔。10 μl微量進(jìn)樣器抽取細(xì)胞懸液10 μl，固定于三維手動(dòng)推進(jìn)儀上，經(jīng)骨孔垂直進(jìn)針6.0 mm，再回退1.0 mm后緩慢將細(xì)胞懸液推注入大鼠顱內(nèi)。推注完畢后留針5 min，待細(xì)胞充分沉淀后緩慢拔出針頭，縫合頭皮切口(見(jiàn)圖1、2)。手術(shù)在無(wú)菌條件下進(jìn)行。手術(shù)結(jié)束后，由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心繼續(xù)按SPF飼養(yǎng)動(dòng)物［1］。接種14 d后分別取大鼠腫瘤組織用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.3 流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞表面MHCⅠ類分子、MHCⅡ類分子、共刺激分子CD80、CD86的表達(dá) 將新鮮大鼠腫瘤組織制成單細(xì)胞懸液，PBS洗1 000 r/min×5 min×2次，分別加入PE標(biāo)記抗大鼠CD80抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記抗大鼠CD86抗體，APC標(biāo)記抗大鼠MHCⅠ類分子抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記抗大鼠MHCⅡ類分子抗體，常溫避光染色30 min，PBS洗1 000 r/min×5 min×2次后用流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05為差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外細(xì)胞表面分子的表達(dá) 9L/IL-18、9L/LXSN及9L細(xì)胞表面 CD80、CD86、MHCⅠ、Ⅱ類分子的表達(dá)均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 IL-18對(duì)腫瘤組織細(xì)胞表面CD80、CD86、MHCⅠ、Ⅱ類分子表達(dá)的影響 接種9L/IL-18細(xì)胞大鼠腫瘤組織中CD80、CD86、MHCⅠ類分子均高于9L/LXSN和9L組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);后兩組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);MHCⅡ類分子的表達(dá)，三組無(wú)顯著差別(P＞0.05)。見(jiàn)圖3、表2。

圖1 立體定向技術(shù)建立動(dòng)物模型Fig.1 Establish animal models by stereotactic technique

圖2 接種不同細(xì)胞10 d后大鼠狀態(tài)Fig.2 Status of rats implanted with different cells for 10 days

表1 不同細(xì)胞表面MHCⅠ、MHCⅡ、CD80和CD86的表達(dá)Tab.1 Expression of MHCⅠ，MHCⅡ，CD80 and CD86 on different cells

表2 不同腫瘤組織MHCⅠ、MHCⅡ、CD80和CD86的表達(dá)Tab.2 Expression of MHCⅠ，MHCⅡ，CD80 and CD86 on different tumor tissue cells

圖3 流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測(cè)接種不同細(xì)胞大鼠腫瘤組織CD80、CD86、MHCⅠ和MHCⅡ的表達(dá)Fig.3 Expression of CD80，CD86，MHCⅠ、MHCⅡ in tumor tissues from rats implanted with different cells by FCM

3 討論

本實(shí)驗(yàn)所用9L膠質(zhì)瘤細(xì)胞源于純種近交系Fischer大鼠，與Fischer344大鼠MHC有高度同源性。研究表明，9L/Fischer344大鼠膠質(zhì)瘤模型在成瘤效果、腫瘤組織形態(tài)學(xué)特點(diǎn)及腫瘤局部細(xì)胞免疫反應(yīng)等方面與C6/Wistar大鼠膠質(zhì)瘤模型均存在明顯差別，前者更適合于腫瘤基因免疫治療的研究［12］。

提高腫瘤細(xì)胞免疫原性，上調(diào)免疫協(xié)同刺激因子的表達(dá)，可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別，從而促進(jìn)局部免疫反應(yīng)，抑制腫瘤的免疫逃逸。本實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染了IL-18基因后，在體外并不影響9L膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面MHC類分子的表達(dá)，然而，在體內(nèi)IL-18可明顯上調(diào)膠質(zhì)瘤組織細(xì)胞表面MHCⅠ類分子表達(dá)，表明在體內(nèi)IL-18可增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞免疫原性，增強(qiáng)CD8+T對(duì)腫瘤的殺傷作用。

研究表明，膠質(zhì)瘤患者的免疫能力下降，主要是T細(xì)胞的抗腫瘤活性下降［9］。膠質(zhì)瘤細(xì)胞可表達(dá)FasL，誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞發(fā)生凋亡(活化T細(xì)胞表達(dá) Fas)，使腫瘤微環(huán)境中浸潤(rùn)的 T 細(xì)胞減少［7，8］。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，9L/IL-18細(xì)胞可明顯上調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面MHCⅠ類分子及共刺激分子CD80、CD86表達(dá)。MHCⅠ類分子的表達(dá)使膠質(zhì)瘤細(xì)胞免疫原性增強(qiáng)，提高免疫系統(tǒng)的免疫監(jiān)視功能;另外共刺激分子CD80、CD86表達(dá)增加，提供了更多T細(xì)胞活化的第二信號(hào)，可以更多地激活T細(xì)胞、促進(jìn)T細(xì)胞增殖、提高T細(xì)胞對(duì)腫瘤抗原的反應(yīng)性。

可見(jiàn)，在體內(nèi)，IL-18可增強(qiáng)9L細(xì)胞的免疫原性及抗原遞呈，提高機(jī)體抗膠質(zhì)瘤能力。我們認(rèn)為IL-18轉(zhuǎn)染對(duì)9L細(xì)胞體內(nèi)外作用不同，是由于在體內(nèi)IL-18對(duì)大鼠整體免疫功能的調(diào)節(jié)增強(qiáng)了局部抗腫瘤作用。另外，在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)接種了9L/IL-18組大鼠外周血中TGF-β水平顯著下降，CD8+T細(xì)胞比例明顯增加，可見(jiàn)IL-18能夠改變膠質(zhì)瘤大鼠外周血免疫抑制狀態(tài)，提高其免疫功能，但是外周血的改變是否影響顱內(nèi)腫瘤微環(huán)境同樣改變還不明確。

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