張玉花，王華明，尹潔，景玉宏

面神經(jīng)損傷是臨床常見病和多發(fā)病。面神經(jīng)損傷后的修復(fù)受制于復(fù)雜的外部環(huán)境及損傷程度[1]，神經(jīng)修復(fù)過程也是面神經(jīng)和所支配的面肌建立突觸聯(lián)系的過程[2]，骨骼肌的功能狀態(tài)可以反向影響其支配的神經(jīng)[3]。有研究顯示，失去神經(jīng)支配后，骨骼肌葡萄糖轉(zhuǎn)運體蛋白4(glucose transporter 4,GLUT4)的表達減少，骨骼肌GLUT4的表達、轉(zhuǎn)位及細胞膜組裝依賴于胰島素信號[4]。我們于損傷面神經(jīng)支配的骨骼肌周圍注射低劑量胰島素，觀察其對損傷面神經(jīng)的反向影響效應(yīng)，并探討其可能的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及造模

雄性Sprague-Dawley大鼠30只，體質(zhì)量250～300 g，由蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物中心提供。自由攝食、飲水，12 h光照周期，恒濕恒溫飼養(yǎng)。

10%水合氯醛360 mg/kg腹腔注射麻醉。無菌條件下暴露左側(cè)莖乳孔外面神經(jīng)主干，出莖乳孔3 mm處用蚊式止血鉗鉗夾面神經(jīng)干，長約2 mm，力量為2扣，持續(xù)15 s。手術(shù)顯微鏡下觀察擠壓部位呈透明薄膜結(jié)構(gòu)。損傷完成后3-0絲線縫合皮下組織及皮膚，再次消毒后縫線固定。

1.2 神經(jīng)功能評分標準

術(shù)后第1天開始，連續(xù)7 d，每天進行神經(jīng)功能評分。①眨眼反射：5 ml注射器距離鼠眼3 cm，瞬間推內(nèi)芯吹風(fēng)2 ml，比較雙側(cè)眨眼反射的速度和幅度。雙側(cè)正常且對稱為0分；減弱或延緩為1分；消失為2分。②觸須運動：刺激方法同眨眼反射，比較雙側(cè)觸須拂動的程度。雙側(cè)拂動正常且對稱為0分；觸須拂動減弱為1分；消失為2分。③鼻尖偏向：觀察鼻尖是否偏向健側(cè)。鼻尖居中為0分；偏向健側(cè)為1分。

1.3 分組及處理

經(jīng)神經(jīng)功能評分，20只評分為5分的大鼠納入實驗。依據(jù)大鼠編號隨機分為治療組和對照組各10只。實驗過程中，2只大鼠因感染被排除。組間平衡后，各組實際統(tǒng)計8只。

治療組局部給予胰島素注射：圍繞損傷側(cè)眼輪匝肌和口輪匝肌取四等分點，微量注射器4點肌內(nèi)等量注射，共250 ng/kg，每天2次，連續(xù)7 d。對照組同法注射等量生理鹽水。注射前、注射后40 min自鼠尾采血，檢測酶底物法血糖水平。

1.4 熒光金逆行標記

術(shù)后第5天，大鼠雙側(cè)耳前切口，于雙側(cè)面神經(jīng)頰支注射1%的熒光金(Fluorogold,FG)各2μl，10 min內(nèi)注射完畢。

術(shù)后第7天，大鼠灌注、固定、取腦干，冰凍切片，片厚25μm，冷凍保護液中放置，-20℃保存?zhèn)溆?。參照大鼠腦圖，選取距前囟-10.56 mm、-10.71 mm、-10.86 mm、-11.01 mm的冠狀切片共4張，裱貼于1%多聚賴氨酸處理的載玻片上，50%甘油封片，熒光顯微鏡紫外激發(fā)光觀察，拍照。200×視野下對雙側(cè)面神經(jīng)核內(nèi)陽性細胞計數(shù)，4張切片取均值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 血糖

注射前后兩組間血糖水平無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

表1 局部胰島素注射對血糖水平的影響(mmol/L)

2.2 神經(jīng)功能評分

術(shù)后1～4 d，兩組大鼠評分無顯著性差異(P>0.05)；術(shù)后5～7 d，治療組各時間點評分均低于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 術(shù)后兩組神經(jīng)功能評分比較

2.3 熒光金逆行標記

損傷對側(cè)面神經(jīng)核可見廣泛神經(jīng)細胞被熒光金標記，兩組間無顯著性差異(P>0.05)。損傷側(cè)熒光金標記的細胞數(shù)量減少，治療組熒光金標記細胞數(shù)明顯多于對照組(P<0.01)。見表3。

表3 各組損傷同側(cè)及對側(cè)熒光金陽性細胞計數(shù)

3 討論

功能鍛煉能促進面神經(jīng)損傷后的功能恢復(fù)；針刺、按摩、局部理療也能促進面神經(jīng)損傷后的功能恢復(fù)[5]。其他治療方法在不同個體間，治療效果有較大差異[6]。

功能鍛煉對神經(jīng)功能的改善作用，與神經(jīng)纖維支配區(qū)微環(huán)境的改善有關(guān)[7-8]。有研究顯示，正中神經(jīng)損傷后，局部給予胰島素注射，能夠改善神經(jīng)功能[9]。我們的研究顯示，面神經(jīng)擠壓傷后，局部給予胰島素注射，能夠改善大鼠神經(jīng)功能評分，增強神經(jīng)纖維的逆行軸漿轉(zhuǎn)運能力，提示胰島素治療能夠促進神經(jīng)纖維出芽及與靶器官建立突觸聯(lián)系。

胰島素面部注射對面神經(jīng)擠壓傷的改善作用是因為其神經(jīng)營養(yǎng)作用，還是依賴于對骨骼肌葡萄糖利用的促進，還無法完全區(qū)分。有報道顯示，周圍神經(jīng)上也有胰島素受體分布[10]，但骨骼肌胰島素受體密度更高；因此局部胰島素主要與骨骼肌胰島素受體結(jié)合，啟動下游信號，尤其促使GLUT4的細胞膜轉(zhuǎn)位和組裝，從而促進骨骼肌葡萄糖的利用，具有更多的專一性[11]。失去神經(jīng)支配的骨骼肌葡萄糖轉(zhuǎn)運及利用下降，而胰島素則可以通過促進骨骼肌GLUT4的表達和轉(zhuǎn)位，維持神經(jīng)損傷后骨骼肌細胞的代謝水平。我們推測，局部注射胰島素對神經(jīng)損傷的改善作用，至少部分是通過骨骼肌實現(xiàn)的。

我們的實驗尚不能證明局部給予外源性的胰島素注射后骨骼肌及神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)方面的變化。進一步研究需要揭示局部胰島素治療對于失神經(jīng)支配骨骼肌的GLUT4的表達和轉(zhuǎn)位、骨骼肌營養(yǎng)因子的分泌、損傷神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)的變化等有何影響，從而探明胰島素治療促進神經(jīng)功能恢復(fù)的途徑和機制。

[1]Garcia N,Tomàs M,Santafe MM,et al.Localization of brain-derived neurotrophicfactor,neurotrophin-4,tropomyosin-related kinase b receptor,and p75NTRreceptor by high-resolution immunohistochemistry on the adult mouseneuromuscular junction[J].JPeripher Nerv Syst,2010,15(1):40-49.

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