陳兆群，蔡蔚斌，陳懷，陳展祥，方少虹

1.汕頭市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，廣東 汕頭 515031；2.汕頭市中醫(yī)醫(yī)院重癥醫(yī)學科，廣東 汕頭 515031；3.汕頭市中醫(yī)醫(yī)院外科，廣東 汕頭 515031

“腸道是應激反應的中心器官之一”這一論點越來越受人們的公認。目前國內(nèi)現(xiàn)已有香連丸有效部位具有抗消化性潰瘍潰瘍[1-3]、抑制胃酸分泌、解痙、抗菌[4]、抗腹瀉[5]、抑制小腸推進、抗炎[6]等作用等藥理作用。但國內(nèi)卻鮮有關于香連丸有效部位對腸保護作用的研究。本實驗通過研究香連丸有效部位對腸黏膜屏障的保護作用，初步分析其作用途徑及機制，為臨床防治腸炎提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用體重2～3kg的清潔級雄性新西蘭兔45只，由汕頭大學醫(yī)學院動物實驗部提供，屏障系統(tǒng)個別籠養(yǎng)，自由攝食、飲水。

1.2 動物模型建立與分組 將所選家兔隨機分為三組：假手術(shù)組(I組)、模型對照組(Ⅱ組)和香連丸組(Ⅲ組)，每組15只。3組家兔術(shù)前12h禁食，禁水4h，清洗動物，備皮。動物稱重后耳緣靜脈給予鹽酸氯胺酮(上海第一生化藥業(yè)有限公司)20～25mg/kg，分離頸內(nèi)靜脈插管。3組動物按無菌操作原則取上腹正中切口4～5cm，輕輕翻出十二指腸。Ⅰ組動物放回十二指腸，逐層關閉腹腔。Ⅱ-Ⅲ組動物在膽總管結(jié)合點上游約1cm處鈍性分離膽總管，用4號絲線提起并結(jié)扎膽總管，回納組織后，逐層關閉腹腔。3組動物均禁食12小時后開放飲食，Ⅱ組給予香連丸有效部位(萸黃連總生物堿和木香揮發(fā)油)。萸黃連生物堿從毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch(吳茱萸制)中提取，總生物堿含量達50%以上，木香揮發(fā)油是從菊科植物云木香Aucklangia lappa Decne中提取，木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯含量之和達50%。香連丸組大鼠每天灌胃1.168g/kg，Ⅰ組和Ⅲ組動物每天灌胃同體積生理鹽水。

1.3 標本采集及預處理 三組動物于術(shù)前及術(shù)后72h取血后處死。血漿分離保存于-70℃冰箱內(nèi)待檢測。取距回盲部約5cm處回腸組織，沿縱軸剪開腸管，清洗腸內(nèi)容物，濾紙吸干水后福爾馬林溶液固定。1.4 血膽紅素水平檢測 用GAMSTAR 自動生化分析儀(美國產(chǎn))測定血清總膽紅素和直接膽紅素，部分結(jié)扎膽總管后引起明顯的高膽紅素血癥，檢驗梗阻性黃疸模型是否建立成功。

1.5 血漿內(nèi)毒素、二胺氧化酶(DAO)含量測定 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，按試劑盒說明書檢測血清內(nèi)毒素、二胺氧化酶(DAO)含量測定。

1.6 小腸黏膜HE染色圖片 小腸組織切片后行HE染色，由病理科醫(yī)師觀察病理學變化并采用Chiu氏6級評分法行病理評分[7]，光鏡下觀察腸黏膜形態(tài)變化。1.7 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)均應用SPSS13.0軟件包進行管理和數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，兩組間計量資料比較采用t檢驗，組內(nèi)術(shù)前術(shù)后計量資料比較采用配對t檢驗。P<0.05為有顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 血膽紅素測定結(jié)果 假手術(shù)組動物手術(shù)前后血清總膽紅素和直接膽紅素差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。模型對照組和香連丸組動物術(shù)后72h血清總膽紅素和直接膽紅素均較手術(shù)前顯著升高(P<0.01)，并且與假手術(shù)組動物比較也顯著升高(P<0.01)，達到中度黃疸水平(見表1)。

表1 三組術(shù)前、后血清總膽紅素水平(±s)對比Tab 1 Serum bilirubin levels before and after surgery in three groups

表1 三組術(shù)前、后血清總膽紅素水平(±s)對比Tab 1 Serum bilirubin levels before and after surgery in three groups

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與手術(shù)前比較，##P<0.01。

組別 血清總膽紅素/mmol/L 血清直接膽紅素/mmol/L術(shù)前 術(shù)后72 h 術(shù)前 術(shù)后72 h假手術(shù)組 2.84±0.80 2.93±0.96 2.13±0.73 2.16±0.85模型對照組 2.89±0.78 24.5±9.59**,## 2.15±0.82 16.73±8.41**,##香連丸組 2.76±0.75 22.5±8.68**,## 2.20±0.93 14.86±8.96**,##

2.2 小腸組織病理學檢查 本實驗使用Chiu氏病理評分法，共有6級：0級為正常小腸黏膜絨毛；1級為在絨毛中軸出現(xiàn)腸黏膜上皮下的Gruenhagen's間隙，常常伴隨毛細血管充血；2級為來自固有膜的腸黏膜上皮抬高以及腸上皮下間隙的擴張，3級為大片腸黏膜上皮抬高，絨毛向兩側(cè)倒伏，部分絨毛頂端脫落；4級為絨毛及固有膜脫落，裸露的毛細血管擴張，可看到固有膜細胞成分構(gòu)成增加：5級為固有膜蛻變或被消化，出血或潰瘍形成。光鏡觀察下(見圖1)，假手術(shù)組chiu氏0級15只；模型對照組小腸黏膜chiu氏3級共3只，Chiu氏評分4級共12只；香連丸組小腸黏膜chiu氏1級共1只，chiu氏2級共12只，chiu氏3級共2只。兩組小腸組織病理學分級對比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表2。

表2 三組小腸組織病理學分級對比Tab 2 Small intestine histopathological grading before and after surgery in three groups

2.3 對兔血中二胺氧化酶(DAO)及血清內(nèi)毒素的測定及影響 假手術(shù)組動物手術(shù)前后血清DAO和內(nèi)毒素水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。模型對照組和香連丸組動物術(shù)后血清DAO和內(nèi)毒素水平均較手術(shù)前顯著升高(P<0.01)，但是香連丸組術(shù)后血清DAO和內(nèi)毒素水平均較模型對照組顯著降低(P<0.01)，見表3。

3 討論

梗阻性黃疸對腸黏膜屏障的破環(huán)機制極其復雜，它包括阻黃對腸黏膜屏障的機械、細菌、免疫、化學屏障和腸肝軸的破壞，其中又包含腸緊密連接的改變、腸道細胞增生與凋亡的失衡、氧化應激、腸道細菌失調(diào)等眾多因素的參與。姚晉林等[8]通過研究發(fā)現(xiàn)，梗阻性黃疸時末端回腸黏膜發(fā)生萎縮、絨毛水腫和部分上皮細胞脫落，這些改變削弱了腸黏膜的屏障功能，腸道菌群從破損的腸黏膜進入內(nèi)臟，導致細菌移位的發(fā)生，說明腸道細菌移位在梗阻性黃疸病理過程中發(fā)揮了重要作用。血二胺氧化酶(DAO)是一種含有脫氨的腐胺和組胺的細胞內(nèi)酶，可將腐胺氧化為氨基丁醛，并進一步環(huán)化成一種吡咯啉，是具有高度活性的細胞內(nèi)酶。小腸黏膜屏障功能衰竭時，腸黏膜細胞脫落入腸腔，DAO進入腸淋巴管和血流，使血中DAO升高。因此，血中DAO活性可反映腸道損傷和修復情況[9]。內(nèi)毒素是革蘭陰性菌細胞壁外膜上的一種脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和微量蛋白質(zhì)的復合物，LPS是它的主要抗原性及致病性部分，在機體免疫力下降等情況下腸道內(nèi)的致病菌，特別是革蘭陰性菌就會大量生長、繁殖并釋放大量的內(nèi)毒素，可直接引起腸黏膜屏障損傷[10]。本實驗通過結(jié)扎膽總管使兔產(chǎn)生梗阻性黃疸，使兔血清內(nèi)毒素及血二胺氧化酶較術(shù)前明顯上升，達到病理意義，且通過光鏡確認家兔回腸黏膜出現(xiàn)損傷。試驗中香連丸組給予香連丸有效部位灌腸，而對照組給予生理鹽水灌腸，結(jié)果香連丸組血二胺氧化酶(DAO)、血清內(nèi)毒素(ET)的含量較模型組明顯降低(P<0.01)，說明香連丸能有效的保護腸黏膜屏障，這可能與香連丸強效的抑菌作用有關。香連丸有效成分能有效抑制腸內(nèi)病原菌生長，減少細菌異位的發(fā)生可能[11]。此外，香連丸有效部位有抑制腸蠕動、減少腸液、胃酸分泌的作用，從而使本來減弱的腸黏膜屏障得到加固，起到抗炎的作用[12]。

表3 三組術(shù)前、后血清DAO及內(nèi)毒素(±s)的變化Tab 3 The changes of diamine oxidase and endotoxin (±s) before and after surgery in three groups

表3 三組術(shù)前、后血清DAO及內(nèi)毒素(±s)的變化Tab 3 The changes of diamine oxidase and endotoxin (±s) before and after surgery in three groups

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與手術(shù)前比較，##P<0.01。

組別 血清DAO/ku/L 血清內(nèi)毒素/pg/mL術(shù)前 術(shù)后 術(shù)前 術(shù)后假手術(shù)組 0.78±0.24 0.83±0.35 0.83±0.31 0.85±0.38模型對照組 0.76±0.34 1.43±0.42**,## 24.60±3.59**,## 130.0±18.9**,##香連丸組 0.79±0.32 1.02±0.37**,##,&& 23.96±4.84**,## 65.5±23.7**,##,&&

圖1 術(shù)后各組腸黏膜形態(tài)變化Fig 1 Histopathological changes in the three groups after the surgery

綜上所述， 香連丸有效部位對兔梗阻性黃疸腸黏膜損傷有明顯的治療作用，可減輕腸道炎癥反應，對腸黏膜起到保護作用，臨床上可用于對腸炎的治療，但關于其機制還需進一步探討。

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