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        晚期結(jié)直腸癌患者DC-CIK免疫干預(yù)前后D二聚體改變的臨床研究

        2014-11-24 02:55:42王睿斌郝筱詩齊保聚任連偉盛敏佳
        關(guān)鍵詞:成年人二聚體直腸癌

        王睿斌,郝筱詩,齊保聚,任連偉,盛敏佳

        (1.北京市大興區(qū)人民醫(yī)院 肛腸外科,北京102600;2.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院2010級放射1班,長春130021;

        3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 婦產(chǎn)科,長春130033)

        惡性腫瘤患者往往伴有血液的高凝狀態(tài),這種高凝狀態(tài)與惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)?;熥鳛閻盒阅[瘤有效干預(yù)手段的同時(shí),可加重這種高凝狀態(tài)甚至形成血栓[1]。近年來,免疫干預(yù)對于腫瘤干預(yù)的有效性得到肯定,并且與單細(xì)胞測序、“普朗克”探測微波背景輻射、人類連接組計(jì)劃、探索南極冰下世界、基礎(chǔ)植物研究共同被列為2013年人類6大科技任務(wù)之一[2]。本實(shí)驗(yàn)的目的在于探討DC-CIK免疫干預(yù)對于晚期結(jié)直腸癌患者凝血功能及D二聚體的影響,進(jìn)一步肯定DC-CIK的有效性及安全性。

        1 資料與方法

        1.1 研究對象

        選擇2011年7月-2012年8月入住我院行DC-CIK免疫干預(yù)的IV期結(jié)直腸癌患者40人,其中男性26例,女性14例(年齡26-85歲),結(jié)腸癌15例,直腸癌25例(見表1)。所有患者在DC-CIK干預(yù)前后1月內(nèi)均未接受放化療?;颊呒捌浞ǘù砣酥椴⑼饨邮茉摳深A(yù)。所有患者在G-CSF動員前5天內(nèi)及DC-CIK免疫干預(yù)1個(gè)月后行凝血功能及D二聚體的檢測。選擇同期體檢的健康成年人43例(年齡31-82歲)行凝血功能及D二聚體檢測作為對照。

        1.2 主要試劑來源

        G-CSF為日本中外制藥株式會社產(chǎn)品。干擾素-γ為上海凱茂生物醫(yī)藥有限公司產(chǎn)品,IL-2為北京四環(huán)生物制藥有限公司產(chǎn)品,CD3單抗為北京同力海源生物技術(shù)開發(fā)公司產(chǎn)品,TNF-α、IL-4、GMCSF為廈門特寶生物股份有限公司產(chǎn)品。纖維蛋白原、凝血酶原時(shí)間、D二聚體檢測試劑盒均為貝克曼庫爾特有限公司產(chǎn)品。

        1.3 凝血功能及D二聚體的檢測方法

        所有患者在G-CSF動員前5天內(nèi)及DC-CIK免疫干預(yù)1個(gè)月后行凝血功能及D二聚體的檢測。檢測儀器為TOP全自動凝血儀,纖維蛋白原采用纖維蛋白原-C XL試劑盒,凝血酶原采用凝血酶原時(shí)間測定試劑盒(凝固法),D二聚體采用D-二聚體測定試劑盒(免疫比濁法)。

        1.4 DC-CIK免疫干預(yù)經(jīng)過

        所有患者經(jīng)骨髓穿刺細(xì)胞學(xué)檢查證實(shí)無骨髓轉(zhuǎn)移,骨髓造血功能大致正常,于-2天起予以G-CSF刺激造血,在-1天給予股靜脈留置雙腔ARROW靜脈導(dǎo)管,-1、0、1天給于速碧林0.4ml皮下注射(共3天,分血后拔除股靜脈置管,停止速碧林皮下注射)。當(dāng)外周血白細(xì)胞﹥1×109/L、淋巴+單核﹥15%后,分兩天采集外周血干細(xì)胞200-250ml。取新鮮血25-50ml行DC-CIK細(xì)胞培養(yǎng)(剩余的-80℃分袋凍存?zhèn)溆茫?。培養(yǎng)7-10天進(jìn)行細(xì)胞回輸,最低細(xì)胞數(shù)量大于1×108,隔日1次,每周期3次。

        1.5 DC-CIK細(xì)胞懸液的制備

        取新鮮外周血干細(xì)胞25-50ml用生理鹽水1∶1稀釋,緩慢加入淋巴細(xì)胞分層液表面上,無菌封蓋,400g,30min,輕輕吸細(xì)胞層,用生理鹽水1 500 rpm,5min,洗3次。細(xì)胞計(jì)數(shù)后,5×106/ml/瓶,將細(xì)胞加入完全培養(yǎng)基(含2.5%自體血漿的1640培養(yǎng)基)中60-80ml/瓶,3瓶放入5%的CO237℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-4h。懸浮細(xì)胞進(jìn)行CIK培養(yǎng),貼壁細(xì)胞進(jìn)行DC培養(yǎng)。然后檢菌—將細(xì)胞與完全培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。

        CIK培養(yǎng):合并懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液并移入完全培養(yǎng)基(含自體血漿的AIM-V),1LAIM-V培養(yǎng)基中加入各種細(xì)胞因子[干擾素-γ1ml(即全部加到1L AIM-V 中),IL-2 1 200μl,CD3單抗5-10μl并首次加1支肝素],放入5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

        DC培養(yǎng):貼壁細(xì)胞加入DC培養(yǎng)基和各種細(xì)胞因子[TNF-α(30μl/30ml),IL-4(60μl/30ml),GMCSF(60μl/30ml)]放入5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

        隔日鏡下觀察,根據(jù)細(xì)胞狀態(tài),補(bǔ)充完全培養(yǎng)基和細(xì)胞因子(含2.5%自體血漿 AIM-V加補(bǔ)IL-2終濃度1μl/ml)。

        回收細(xì)胞后生理鹽水低速離心,洗3次。用適量含有12.5%血漿蛋白的生理鹽水重懸細(xì)胞,回輸患者。

        1.6 統(tǒng)計(jì)方法

        所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,配對t檢驗(yàn),采用SPSS 13.0軟件包分析。

        2 結(jié)果

        2.1 DC-CIK細(xì)胞的流式檢測結(jié)果

        所培養(yǎng)的DC和CIK細(xì)胞以1∶3的比例混合,所得細(xì)胞總數(shù)大于1×108,圖1為患者CIK細(xì)胞流式檢測結(jié)果圖例。

        圖1 某患者CIK細(xì)胞流式檢測結(jié)果

        2.2 晚期結(jié)直腸癌患者凝血功能與健康成年人的比較

        所有晚期結(jié)直腸癌患者的D二聚體、FIB、PT%、INR均高于健康成年人(數(shù)據(jù)未顯示)。

        40例晚期結(jié)直腸癌患者在DC-CIK免疫干預(yù)1月后D二聚體水平仍高于健康成年人,并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),F(xiàn)IB、PT%、INR也高于健康成年人,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),詳見表1。

        表1 40例晚期結(jié)直腸癌患者免疫干預(yù)1月后與健康成年人凝血功能及D二聚體的比較

        2.3 DC-CIK免疫干預(yù)前后凝血功能的比較

        40例晚期結(jié)直腸癌患者在DC-CIK免疫干預(yù)前后D二聚體水平明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),F(xiàn)IB、APTT、PT%、INR也有所下降,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),詳見表2。

        表2 40例晚期結(jié)直腸癌患者DC-CIK免疫干預(yù)前后凝血功能及D二聚體的變化

        3 討論

        惡性腫瘤患者往往伴有凝血功能異常——血漿纖維蛋白原增高[3]及D二聚體明顯增高,這與腫瘤高負(fù)荷導(dǎo)致的過度纖溶有關(guān)[4]。腫瘤患者患靜脈血栓的風(fēng)險(xiǎn)是健康人的7倍,而且是該人群的第二大死因[5],甚至有日本學(xué)者報(bào)道D二聚體可作為晚期結(jié)直腸癌的獨(dú)立不良預(yù)后因素[6]。化療是腫瘤患者干預(yù)的重要手段,但化療過程中腫瘤組織壞死產(chǎn)物及毒素對臨近組織和血管造成損傷,可激活凝血過程,從而增加靜脈血栓的風(fēng)險(xiǎn)[7],臨床上有待于發(fā)現(xiàn)一種有效并安全的干預(yù)手段。至2009年美國FDA批準(zhǔn)了全球第一個(gè)免疫干預(yù)產(chǎn)品以來,人們對免疫干預(yù)對于腫瘤干預(yù)的有效性得到了肯定,我們的研究表明,DC-CIK免疫干預(yù)同時(shí)也可降低晚期結(jié)直腸癌患者D二聚體的水平,降低靜脈血栓風(fēng)險(xiǎn),和化療相比更安全。

        DC細(xì)胞是重要的抗原遞呈細(xì)胞,在介導(dǎo)免疫細(xì)胞的抗腫瘤活性中起著非常重要的作用。CIK細(xì)胞是非組織相容性復(fù)合物和非T細(xì)胞受體限制性的免疫活性細(xì)胞[8],既具有NK細(xì)胞的非 MHC限制性抗腫瘤作用也具有T細(xì)胞的抗腫瘤活性,抗瘤譜廣。和單獨(dú)培養(yǎng)的CIK細(xì)胞相比,DC-CIK的抗腫瘤活性更強(qiáng),增殖速度更快并且凋亡速度更慢,CD3+CD56+細(xì)胞比例更高[9.10],并且對多藥耐藥的腫瘤細(xì)胞的療效更好[11]。

        已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道術(shù)后聯(lián)合DC-CIK、化療聯(lián)合DC-CIK 的有效性[12.13],任軍等[12]對比了轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者標(biāo)準(zhǔn)劑量紫杉醇加塞替哌方案化療與大劑量該方案聯(lián)合DC-CIK免疫治療的PFS和OS,結(jié)果顯示DC-CIK組與標(biāo)準(zhǔn)劑量化療組相比,OS延長17.9個(gè)月(33.1比15.2),PFS延長6.5個(gè)月(10.2比3.7),差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究旨在探討DC-CIK免疫干預(yù)在有效的同時(shí)對于凝血功能及D二聚體的影響。結(jié)果表明,干預(yù)后D二聚體明顯下降(P=0.005),說明DC-CIK免疫干預(yù)可大大降低患者的靜脈血栓的風(fēng)險(xiǎn),我們認(rèn)為這與免疫干預(yù)后腫瘤負(fù)荷降低有關(guān)。我們的研究中患者在置管后及每日分血后均給于速碧林0.4ml皮下注射(僅3次),但根據(jù)速碧林的藥代動力學(xué),該藥皮下注射后3小時(shí)血漿濃度達(dá)到高峰,而后5h進(jìn)入半衰期,大約10-12h完全排出體外,故而對1月后的凝血功能及D二聚體沒有影響。本研究中干預(yù)后患者的D二聚體水平仍然高于同期體檢的健康成年人(P=0.03),可能與干預(yù)后仍有一定腫瘤負(fù)荷有關(guān)。另外,干預(yù)前后FIB也有明顯下降,但P=0.067尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,我們不排除與樣本量較少對結(jié)果的影響,隨著研究的樣本量進(jìn)一步擴(kuò)大尚待進(jìn)一步觀察。

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