張敏敏，李玉璽，張麗艷

(濱州學(xué)院 生命科學(xué)系，山東 濱州 256603)

磷是植物生長必需的營養(yǎng)元素之一，它既是植物體內(nèi)許多重要有機(jī)化合物的組分，又以多種方式參與植物體內(nèi)各種代謝過程，在人類賴以生存的土壤－植物－動物生態(tài)系統(tǒng)中起著不可替代的作用［1］。土壤平均含磷量是0.05 (W/W)，但只有0.1 能被植物吸收，我國有74 的耕地土壤缺磷，土壤中95 的磷為無效形式，土壤有效磷的缺乏是限制植物生長的主要因素之一。為了獲得高產(chǎn)，人們每年都向土壤反復(fù)施加大量可溶性磷肥，由于作物對施入的磷肥當(dāng)季利用效率只有5 ～10，大部分與土壤中的金屬離子結(jié)合形成難溶性磷酸鹽。土壤中存在大量的具有解磷能力的微生物，能夠?qū)㈦y溶性的磷酸鹽如磷礦粉轉(zhuǎn)化為水溶性磷，提高土壤中的可溶性磷含量，從而改善植物磷素營養(yǎng)，提高作物產(chǎn)量［2－3］。本文以沾化冬棗為研究對象，從其根圍土壤中分離篩選具有較強(qiáng)解磷能力的細(xì)菌ZMM－3，對其菌落菌株形態(tài)、理化性質(zhì)、最佳培養(yǎng)條件等進(jìn)行研究，為以后微生物解磷、提高土壤中水溶性磷和制備菌肥提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

本實(shí)驗所用土壤樣品取自濱州市沾化縣下洼鎮(zhèn)大王村冬棗園棗樹根系周圍。

1.1.2 主要培養(yǎng)基

蒙金娜無機(jī)磷培養(yǎng) 基［4－6］:葡萄 糖 10 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，Ca3(PO4)210g，酵母膏0.4 g，水1 000 mL，pH值7.0～7.5。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基［7］:牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0。

1.1.3 主要試劑和儀器

實(shí)驗所用鉬酸銨、酒石酸銻鉀、磷酸二氫鉀、濃硫酸、Ca3(PO4)2等試劑均為分析純。高速低溫離心機(jī)為Beckman Coulter的Allegra X－22R;分光光度計為TU－1810系列。

1.2 方法

1.2.1 解磷微生物的初篩及純化

準(zhǔn)確稱取10 g土壤樣品置于90 mL無菌水中，充分震蕩混勻制成土壤懸液，將土壤懸液梯度稀釋，取稀釋液200 μL涂布在蒙金娜無機(jī)磷固體培養(yǎng)基上，將涂布好的平板用封口膜封口倒置于生化培養(yǎng)箱(30℃，150 r/min)中培養(yǎng)7 d。菌落長出之后，通過觀察菌落產(chǎn)生透明圈(測量其透明圈直徑D、菌落直徑d，D/d＞1.4)的大小來篩選解磷菌［7］。挑取具有較大透明圈的單菌落進(jìn)行多次純化，直至通過平板和鏡檢觀察確定其為純培養(yǎng)物后，挑取該細(xì)菌單菌落轉(zhuǎn)至牛肉膏蛋白胨平板(37℃)上培養(yǎng)24 h，待菌落長出將分離得到的菌株均置于4℃冰箱保存。

1.2.2 解磷微生物的復(fù)篩

挑取各初篩細(xì)菌菌株的單菌落，放于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30℃往復(fù)震蕩培養(yǎng)至發(fā)酵液變渾濁。將發(fā)酵液進(jìn)行離心，10 000 r/min，離心5 min，棄上清，用無菌水將沉淀物重懸，制成菌懸液。按5 接種量將菌懸液接入100 mL蒙金娜無機(jī)磷液體培養(yǎng)基中，30℃搖床培養(yǎng)7 d之后將發(fā)酵液進(jìn)行離心，10 000 r/min離心5 min，取上清。采用鉬銻抗比色法定量測定上清液中可溶性磷的含量，以不接菌的培養(yǎng)液為空白對照。通過對比各發(fā)酵液中溶磷量的大小，篩選出高效解磷菌［2－8］。

1.2.3 菌落、菌株形態(tài)觀察及菌株革蘭氏染色觀察［9－10］

觀察初篩及復(fù)篩平板上菌落的形態(tài)特征(大小、顏色、質(zhì)地、透明度、表面狀況、邊緣狀況、形狀及隆起程度)，油鏡下觀察菌株形狀，對菌株進(jìn)行革蘭氏染色，觀察。

1.2.4 菌株理化性質(zhì)研究

1)淀粉水解實(shí)驗

挑取斜面培養(yǎng)基上的菌株接種至淀粉培養(yǎng)基平板上，30℃恒溫培養(yǎng)48 h。打開培養(yǎng)皿蓋，滴加幾滴革氏碘液，輕轉(zhuǎn)使碘液均勻鋪滿整個平板，若出現(xiàn)無色透明圈，則說明淀粉已水解，呈陽性，否則為陰性。

2)油脂水解實(shí)驗

挑取斜面上的菌株接種至油脂培養(yǎng)基，30℃恒溫培養(yǎng)48 h。觀察平板上菌落生長的地方，若出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，說明油脂已被分解，為陽性，否則為陰性。

3)明膠液化實(shí)驗

用穿刺培養(yǎng)法，接種菌株于明膠培養(yǎng)基中，30℃恒溫培養(yǎng)48 h，將試管置于冰浴中，觀察培養(yǎng)基有無液化情況及液化后的形狀。

4)甲基紅實(shí)驗

按照1 的接種量接菌懸液于葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基中，30℃恒溫、200 r/min搖床培養(yǎng)48 h。加入3～4滴甲基紅試劑，若變紅色，則為陽性;若變黃色，則為陰性。

5)V－P反應(yīng)

按照1 的接種量接菌懸液于葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基中，30℃恒溫、200 r/min搖床培養(yǎng)48 h。取2 mL發(fā)酵液于試管中，再加入2 mL V－P試劑，充分震蕩2 min，37℃水浴30 min，顏色變紅為陽性，否則為陰性。

6)檸檬酸鹽利用實(shí)驗

挑取斜面上的菌株接種至檸檬酸鹽培養(yǎng)基斜面上，30℃恒溫培養(yǎng)48 h。觀察培養(yǎng)基上有無細(xì)菌生長和是否變色。若呈藍(lán)色，則為陽性;若呈綠色，則為陰性。

7)吲哚實(shí)驗

按照1 的接種量接菌懸液于蛋白胨培養(yǎng)基中，30℃恒溫、200 r/min搖床培養(yǎng)48 h。取5 mL發(fā)酵液于試管中，加入2 mL乙醚(呈明顯的乙醚層)，充分震蕩，靜置片刻，沿壁加入10滴吲哚試劑，再震蕩，靜置，若乙醚層呈現(xiàn)玫瑰紅色，則為陽性，否則為陰性。

8)過氧化氫酶實(shí)驗

在潔凈的載玻片中央滴2滴3 的過氧化氫溶液，挑取斜面培養(yǎng)基上的菌落，涂抹于過氧化氫溶液中，若產(chǎn)生氣泡，則為陽性;不產(chǎn)生氣泡，則為陰性。

1.2.5 菌株生長與培養(yǎng)時間的關(guān)系

將高效解磷菌株接入牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中制備其菌懸液，按5 的接菌量接入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中，混勻后，分裝到滅菌的試管中，每支試管裝5 mL，用滅過菌的棉塞封口;每隔2 h取樣，每次取三支試管，放于4℃冰箱中，最后一起在600 nm下測定發(fā)酵液的光吸收值，確定最佳培養(yǎng)時間。

1.2.6 pH值對菌株生長的影響

將高效解磷菌株接入牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中制備其菌懸液，按5 接菌量分別接入pH值為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，每個pH梯度設(shè)置三個同等實(shí)驗。30℃恒溫、200 r/min搖床培養(yǎng)24 h，測其在600 nm處的光吸收值，確定最佳pH值。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效解磷菌的篩選

利用蒙金娜固體培養(yǎng)基分離所采集的沾化冬棗根際土壤中的解磷細(xì)菌，獲得4株能產(chǎn)生明顯溶磷圈的細(xì)菌，說明這些菌株具有溶解無機(jī)磷能力，將這些細(xì)菌分別命名為ZMM－1至ZMM－4。利用蒙金娜液體培養(yǎng)基培養(yǎng)初篩菌株7 d后，測定發(fā)酵液中的可溶性磷含量，發(fā)現(xiàn)ZMM－3菌株的溶磷能力較強(qiáng)，發(fā)酵液中可溶性磷含量為72.26 mg/L，對照組的僅為6.23 mg/L。

2.2 菌落、菌株形態(tài)及菌株革蘭氏染色特征

對高效解磷菌的菌落特征進(jìn)行觀察，可以看出菌株ZMM－3菌落如圖1所示，菌落呈乳白色、圓形、表面凸起、菌落較小、邊緣圓整、不透明、黏稠。菌株革蘭氏染色如圖2所示，呈陰性，油鏡下觀察為桿菌。

圖1 ZMM－3菌落

圖2 ZMM－3革蘭氏染色(10×100)

2.3 菌株生理、生化特征

解磷菌ZMM－3生理、生化特征如表1所示，淀粉水解實(shí)驗中，滴加碘液后，出現(xiàn)無色透明圈，說明淀粉已被水解，呈陽性。油脂水解實(shí)驗中，培養(yǎng)48 h后，平板上出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，說明油脂已被水解，呈陽性。明膠液化實(shí)驗中，冰浴后，穿刺周圍呈現(xiàn)漏斗狀，說明明膠已液化，呈陽性。甲基紅實(shí)驗中，加入甲基紅試劑后，溶液變?yōu)辄S色，呈陰性。V－P反應(yīng)中，水浴30 min后，顏色變?yōu)榧t色，陽性。檸檬酸鹽利用實(shí)驗中，斜面上有菌落產(chǎn)生，且變?yōu)樗{(lán)色，呈陽性。吲哚實(shí)驗中，加入乙醚后，出現(xiàn)分層，乙醚層最終變?yōu)槊倒寮t色，呈陽性。過氧化氫酶實(shí)驗中，出現(xiàn)大量的氣泡，說明菌株產(chǎn)生了過氧化氫酶，并將過氧化氫氧化，呈陽性。

表1 解磷菌ZMM－3生理、生化性質(zhì)

2.4 pH值對菌株生長的影響

以菌株在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)時間為橫軸，以菌株在不同時間段的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基在600 nm處的吸光度值為縱軸，繪制生長曲線。pH值不同的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基對菌體的生長有明顯的影響，如圖3所示。當(dāng)基本培養(yǎng)基的pH值處于5～7之間時，菌株OD600值呈上升趨勢;當(dāng)基本培養(yǎng)基pH值超過7以后，菌株OD600值下降;特別是當(dāng)pH值超過9后，OD值迅速下降，對菌株的生長影響較大，因此，該菌株最佳生長pH值為7。

圖3 pH值對ZMM－3生長的影響

2.5 菌株生長與培養(yǎng)時間的關(guān)系

以菌株在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)時間為橫軸，以菌株在不同時間段的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基在600 nm處的吸光度值為縱軸，繪制菌株生長與培養(yǎng)時間的關(guān)系，如圖4所示。0～6 h內(nèi)解磷細(xì)菌處于延滯期，6～16 h內(nèi)菌株大體處于對數(shù)生長期，12～23 h內(nèi)大體處于典型生長曲線的穩(wěn)定期，之后逐漸進(jìn)入衰亡期，因此，菌株的最佳培養(yǎng)時間為16 h。

圖4 ZMM－3生長與培養(yǎng)時間的關(guān)系

3 結(jié)束語

本研究從沾化冬棗的根際土壤中分離得到一株高效溶無機(jī)磷細(xì)菌ZMM－3，在此基礎(chǔ)上研究了形態(tài)學(xué)特征、理化性質(zhì)、培養(yǎng)條件等。發(fā)現(xiàn)該菌株為革蘭氏陰性桿菌，菌落呈乳白色、圓形、表面凸起、菌落較小、邊緣圓整、不透明、黏稠;淀粉水解實(shí)驗、油脂水解實(shí)驗、明膠液化實(shí)驗、檸檬酸鹽利用實(shí)驗、吲哚實(shí)驗、P－V實(shí)驗和過氧化氫酶實(shí)驗均呈陽性，甲基紅實(shí)驗呈陰性;最佳培養(yǎng)時間為16 h，培養(yǎng)基最適合pH值為7。

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