張金亞，程君生，馮 宇，丁家波，王 楠，皮向成，吳 競，張東東，朱良全?，毛開榮?

（1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081；2.山東農業(yè)大學動物科技學院，山東泰安271018；3.中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193）

布魯氏菌是革蘭氏陰性、胞內寄生兼性需氧菌，可導致多種動物和人患布魯氏菌?。ú疾。?，造成嚴重的公共衛(wèi)生問題和經濟損失。布魯氏菌目前分為6種陸生、4種海洋布魯氏菌［1-2］。牛種布魯氏菌、羊種布魯氏菌、豬種布魯氏菌是流行廣泛的經典布魯氏菌［3-5］。

1932 年Wilson和Miles提出布魯氏菌A、M抗原決定簇的假設。經試驗證實S-LPS含四種抗原決定簇：A、M、C、C／Y，并根據(jù)A 和M 比例，分為 A、M、C（M＞A）、C（M＝A）、C／Y（M＞A）、C／Y（M＝A）、C／Y（A＞M）等 7 類［6-7］。

田間布魯氏菌血清學檢驗時，菌株間交叉反應會影響布病病原的鑒別診斷。通過A、M因子血清，可輔助布病病原的種屬鑒別。Pandit等［8］提出了血清與異種抗原交叉吸收的方法，Jones等［9］用活菌2308株和 16M 株、Wilson等［10］用活菌 A544株和16M株制備過因子血清，但國內未見制備因子血清的文獻報道。本試驗選用滅活的16M株和2308株布魯氏菌免疫家兔制備了A、M因子血清，并優(yōu)化了交叉吸收條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及來源 牛種布魯氏菌2308株（CVCC788）、羊種布魯氏菌 16M 株（CVCC70002）均來自國家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心。

1.1.2 主要試劑和儀器 大豆酶消化蛋白胨瓊脂（Tryptic Soy Agar，TSA）培養(yǎng)基，購自BD公司。布魯氏菌病試管凝集試驗抗原參考品（簡稱“抗原參考品”） ，規(guī)格：5 mL／瓶，批號：S0100220130312；布魯氏菌病陽性血清，規(guī)格：1 mL／瓶，批號：2001-5；布魯氏菌病試管凝集試驗陰性血清，規(guī)格：1 mL／瓶，批號：2001-5；均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所人畜共患病實驗室提供。16M試管凝集試驗抗原、2308試管凝集試驗抗原（簡稱“16M抗原、2308抗原”）按照《獸用生物制品規(guī)程》（2000年版）制備［11］。疫苗佐劑（納米703佐劑）由北京生泰爾生物科技有限公司提供。

1.1.3 實驗動物 1.5～2 kg雄性新西蘭大耳白兔，普通級，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 高免血清的制備

1.2.1.1 種子制備 取2308、16M菌株凍干用菌種各1支，分別啟封后，用1 mL蛋白胨水稀釋，參考OIE方法［12］劃線接種TSA瓊脂平板各2塊，37℃培養(yǎng)72 h，低倍顯微鏡觀察各平板菌落形態(tài)，選取10個各典型菌落分別劃線接種TSA瓊脂斜面3支，置2～8℃保存不超過1個月，備用。

1.2.1.2 細菌懸液及滅活疫苗的制備 分別將各布魯氏菌菌株密集劃線接種于TSA瓊脂扁瓶，置37℃培養(yǎng)48～72 h，每個扁瓶用3～5 mL 0.5%的苯酚生理鹽水沖洗培養(yǎng)物制成懸液，經4層滅菌紗布過濾，去除殘留瓊脂。其余菌液80℃水浴2 h滅活［12］。滅活菌液用滅菌生理鹽水洗滌3～4次后，重新懸浮，調整菌液濃度至 1.2×1011CFU／mL。取適宜體積的該濃度的菌懸液與納米703佐劑按2∶1比例（V∶V）制成滅活佐劑苗。

1.2.1.3 動物免疫及血清抗體消長規(guī)律監(jiān)測 以6×1010CFU／只頸背部皮下分點注射1.5～2 kg家兔各5只。一免后40 d，以2倍劑量進行二免。二免5 d后，耳緣靜脈采血，2 mL／次，常規(guī)方法分離血清并用微量試管凝集試驗（MAT）監(jiān)測抗體效價消長規(guī)律。MAT試驗參照OIE法［12］進行，將待檢血清用0.5%苯酚生理鹽水作1∶10倍稀釋，然后倍比稀釋至1∶5120，在96 U孔凝集板中加入待檢血清50 μL，然后分別加入用0.5%苯酚生理鹽水作1∶20稀釋的抗原參考品、16M抗原和2308抗原，37℃孵育22 h，觀察結果，并設立陰、陽性血清對照。

1.2.2 單因子血清的制備

1.2.2.1 血清交叉吸收條件的優(yōu)化 將布魯氏菌菌液用PBS緩沖液洗滌2～3次，8000 r／min離心15 min，棄上清，然后將待吸收血清與吸收用抗原充分混合。制備因子血清的交叉吸收體系見表1。

表1 血清抗原交叉吸收體系

按以下3組單項參數(shù)進行血清交叉吸收條件的優(yōu)化：（1）異種抗原／血清質量體積比（W／V）分別為1 ∶5、1 ∶10及 1 ∶20；（2）吸收溫度及時間分別為4℃吸收2 h、4℃吸收12 h及37℃吸收2 h；（3）吸收過程中混勻方式分別采取每20 min混勻1次以及130 r／min振蕩孵育。

1.2.2.2 血清交叉吸收后凝集價的測定 吸收后的菌液以 8000 r／min離心 15 min，棄菌體。按1.2.1.3項方法通過MAT檢測血清對抗原標準品、16M抗原和2308抗原的抗體反應效價，比較分析并確定最適單因子血清制備參數(shù)。

1.2.2.3 最佳反應稀釋濃度的確定 取經滅菌生理鹽水適當稀釋的因子血清30 μL，加入30 μL凝集試驗抗原進行玻片凝集試驗，以1～2 min內出現(xiàn)凝集判為陽性，判定單因子血清對16M抗原和2308抗原的反應情況，從而確定最佳反應稀釋濃度。

1.2.3 血清分裝、凍干及鑒定 將優(yōu)化條件下制取的A、M因子血清，加入適量硫柳汞，使其終濃度為0.01%。按1 mL／瓶分裝、凍干。

1.2.3.1 無菌檢驗 隨機取凍干血清3瓶，每瓶用1 mL滅菌生理鹽水溶解后，按現(xiàn)行《中國獸藥典》進行無菌檢驗［13］。

1.2.3.2 特異性檢驗 任取1瓶凍干因子血清，按照1.2.2.3的方法進行特異性檢驗。觀察并記錄結果。

1.2.3.3 效價測定 參考OIE方法［12］，采用抗原參考品、16M抗原、2308抗原進行MAT試驗。

2 結果與分析

2.1 家兔抗體效價變化情況 分別用抗原參考品、2308抗原、16M抗原監(jiān)測2308株和16M株免疫的家兔的抗體消長規(guī)律，結果見圖1?？梢钥闯觯瑢?308試驗組，三者測得的抗體變化趨勢基本一致；對16M試驗組，16M抗原與抗原參考品監(jiān)測得到的抗體效價消長規(guī)律一致，且與2308試驗組相似，基本表現(xiàn)為一免后20 d抗體效價處于較高水平，隨后開始下降，到二免前（首免第40 d）已經明顯下降到較低水平，二免后5 d抗體水平顯著上升，15日抗體水平達到較高水平，隨后下降。由于2308抗原與16M抗血清的反應性不佳，故用2308監(jiān)測16M抗體產生規(guī)律時，其結果偏離以16M或以抗原參照品監(jiān)測的結果（圖1）。

圖1 家兔抗體消長圖

2.2 血清中抗體的交叉吸收

2.2.1 血清吸收條件的優(yōu)化 以用16M抗原吸收兔抗2308血清為例，按表2的吸收條件分別進行預實驗。吸收前兔抗2308血清對抗原參考品、16M抗原、2308抗原的凝集價分別為1∶1280、1∶320、1∶640。血清交叉吸收后用MAT測吸收后血清對抗原參考品、16M抗原、2308抗原的凝集價，結果見表2。

表2 血清吸收條件的方法優(yōu)化及結果

比較血清交叉吸收后的對不同抗原的凝集價，確定當抗原與血清質量體積比（W／V）為1∶5時，37℃水浴2 h，期間每隔20 min振蕩混勻1次為最適交叉吸收條件。

2.2.2 血清交叉吸收后凝集價的測定 經優(yōu)化條件制備得單因子血清后，對因子血清進行特異性的鑒定，結果見表3和表4。

表3 因子血清對參考抗原及同種抗原的凝集價（MAT）

表4 因子血清對異種抗原的凝集價（MAT）

MAT結果顯示：A因子血清對抗原參考品和2308抗原的凝集價均為1∶320（++），對16M抗原凝集價為1∶2.5不凝集；M因子血清對抗原參考品和16M抗原的凝集價均為1∶160（++），對2308抗原的凝集價為1∶2.5為凝集。

2.2.3 因子血清最佳稀釋倍數(shù)的確定 經優(yōu)化條件制備得因子血清后，對因子血清進行最佳稀釋倍數(shù)的確定，結果見表5。

表5 因子血清稀釋倍數(shù)的確定

玻片凝集試驗顯示，A因子血清對16M抗原在1∶1時無凝集，對2308抗原在1∶16時有較明顯凝集顆粒，1∶32稍凝集；M因子血清對2308抗原在1∶1時無凝集，對16M抗原在1∶16時有較明顯凝集顆粒，1∶32稍凝集。因子血清對異種抗原在血清原倍的情況下已無凝集現(xiàn)象，但仍建議在進行玻片凝集試驗時對血清進行1∶2的稀釋。

2.3 單因子血清的鑒定 對經分裝凍干的因子血清進行無菌檢驗，證實無菌。經MAT檢測因子血清凍干后對不同抗原凝集價，結果顯示：分裝凍干后的A因子血清對2308抗原的凝集價為1∶320（++），對16M 抗原為 1 ∶2.5不凝集；M 因子血清對16M抗原的凝集價為1∶160（++），對2308抗原的凝集價為1∶2.5不凝集；與凍干前凝集價比較，發(fā)現(xiàn)凍干對A因子血清和M因子血清對抗原的的凝集價無影響。經玻片凝集試驗測定血清的最佳稀釋比例，結果顯示：分裝凍干后的A因子血清對16M抗原在1∶1時無凝集，對2308抗原在1∶16時有較明顯凝集顆粒，1∶32稍凝集；分裝凍干后的M因子血清對2308抗原在1∶1時無凝集，對16M抗原在1∶16時有較明顯凝集顆粒，1∶32稍凝集；與凍干前比較，發(fā)現(xiàn)凍干對A因子血清和M因子血清的最佳稀釋比例無影響。

3 討論與小結

3.1 最適吸收條件的確定 參照文獻報道的因子血清交叉吸收條件［8-10］并進行了優(yōu)化。本試驗選用37℃和4℃兩種溫度，2 h和12 h兩種時間，1∶5、1∶10、1∶20三種抗原血清質量比，以及恒溫搖床振蕩及每20 min振蕩混勻兩種孵育模式分別進行了試驗，對比吸收后因子血清的抗體效價及對同種抗原、異種抗原的反應情況，最終確定在抗原與血清質量體積比（W／V）為1∶5時，37℃水浴2 h，期間每隔20 min振蕩混勻1次為最適宜的吸收條件。

3.2 最適采血時間的確定 文獻報道活菌一免后6 d，不經二免，最適宜采血并進行交叉吸收［9］。但試驗發(fā)現(xiàn)，如免疫后較短時間內采血，此時血清對異種抗原的凝集價相對較低，但血清的抗體效價并不很高，經異種抗原交叉吸收后對同種抗原的凝集價也較低（1∶80左右）［10］；而二免后抗體效價上升，盡管血清對異種抗原凝集價升高，但血清經交叉吸收后對同種抗原的凝集價較高（1∶160和1∶320），故建議先獲得高免血清（≥1∶2560），再進行血清的交叉吸收。

3.3 本試驗的優(yōu)點 以往制備因子血清大都采用活菌免疫［8-10］，而本試驗選用滅活的 16M株和2308株免疫家兔，操作安全。對比文獻制備的因子血清與試驗制備的因子血清發(fā)現(xiàn)，試驗制備的因子血清特異性更強，抗體效價高。

［1］Foster G， Osterman B S， Godfroid J， et al.Brucella ceti sp.nov.and Brucella pinnipedialis sp.nov.for Brucella strains with cetaceans and seals as their preferred hosts［J］.Int J Syst Evol Microbiol， 2007， 57： 2688-2693.

［2］Whatmore A M.Current understanding of the genetic diversity of Brucella， an expanding genus of zoonotic pathogens［J］.Infect Genet Evol， 2009， 9： 1168-1184.

［3］Alton G G， Jones L M， Angus R D， et al.Techniques for the brucellosis laboratory［M］.Paris： Institut National de la recherch Agronomique，1988.

［4］Corbel M J， Banai M.Genus I.Brucella Meyer and Shaw Bergey’s manual of systematic bacteriology［M］.Springer， 2005： 370-386.

［5］Manual of standards for diagnostic tests and vaccines［M］.Pairs：Office International des Epizooties，2009.

［6］Wilson G S， A A Miles.The serological differentiation of smooth strains of the Brucella group［J］.Br J Exp Pathol， 1932， 13：1-13.

［7］Weynants V， Gilson D， Cloeckaert A， et al.Characterization of smooth lipopolysaccharides and O polysaccharides of Brucella species by competition binding assays with monoclonal antibodies［J］.Infect Immun， 1997， 65： 1939-1943.

［8］Jointment FAO／WHO Expert Committee on Brucellosis［M］.Wld Hlth Org techn， 1953： 67.

［9］Jones L M A.Recommended method for the preparation of monospecific Brucella sera［M］.Bull.World Health Org， 1958， 19：177-186.

［10］Diaz R， L M Jones， D Leong， et al.Surface antigens of smooth Brucellae［J］.Bacteriol， 1968， 96： 893-901.

［11］農業(yè)部獸用生物制品規(guī)程委員會.中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程 二○○○版［M］.北京：化學工業(yè)出版社，2010：273-277.

［12］Office International Des Epizooties.OIE terrestrial manual［M］.World Organization for Animal Health， 2009： 15-16.

［13］中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二○一○版三部［S］.北京：中國農業(yè)出版社，2011：68-69，附錄26.