馮翠蘭，劉富來

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 佛山 528231)

金黃色葡萄球菌腸毒素（staphylococcal enterotoxin，SE）主要是由血漿凝固酶或耐熱核酸酶陽性的菌株所產(chǎn)生的一類結(jié)構(gòu)相關(guān)、毒力相似、抗原性不同的胞外蛋白質(zhì)，為單肽鏈蛋白質(zhì)[1]。近年來的研究表明，金黃色葡萄球菌腸毒素具有獨特高效的誘導(dǎo)機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)的特性，把它作為抗腫瘤生物制劑，應(yīng)用于抗腫瘤療法中，將會有廣泛的應(yīng)用前景[2-3]。

食品安全是一個重大的世界性公共衛(wèi)生問題，由金黃色葡萄球菌及其腸毒素引起的中毒案例越來越多，占細(xì)菌性食物中毒第一位，而攜帶SEA-SEE基因的金黃色葡萄球菌引起的食物中毒占金黃色葡萄球菌食物中毒的95%，SE引起的食物中毒和其他相關(guān)疾病給我們的生活帶來很大的威脅，由此造成的經(jīng)濟(jì)損失也相當(dāng)嚴(yán)重[4]。金黃色葡萄球菌食物中毒是因進(jìn)食含有腸毒素的食物，并非活菌所引起，傳統(tǒng)常規(guī)法檢測腸毒素需要經(jīng)過增菌、分離培養(yǎng)、生化鑒定等一系列繁瑣步驟來完成，比較復(fù)雜、不敏感，費(fèi)時費(fèi)力，全過程大概需要4～8 d，在基層單位難以做到。而且由于該菌廣泛存在，僅檢出金黃色葡萄球菌，而無腸毒素的檢出，是很難作為食物中毒主要依據(jù)來判斷。近年來，國際上已將腸毒素檢測列入食品檢驗法規(guī)。因此，建立敏感、快速、特異的食品中的腸毒素檢測方法，是食品檢測的一項重要研究內(nèi)容，對疾控系統(tǒng)快速檢出結(jié)果有重要作用，對于保證食品安全衛(wèi)生有著十分重大的現(xiàn)實意義[5-6]。

因此，研究金黃色葡萄球菌產(chǎn)腸毒素規(guī)律，有利于弄清腸毒素的產(chǎn)生情況和進(jìn)行量的提取擴(kuò)增，促進(jìn)腸毒素快速檢測方法的建立和抗癌產(chǎn)品的研發(fā)，對于保障食品安全和臨床醫(yī)學(xué)抗腫瘤有重要意義。

1 材料與方法

1.1 金黃色葡萄球菌 質(zhì)控金黃色葡萄球菌（ATCC 25923-3）和腸毒素產(chǎn)毒培養(yǎng)基，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司提供；產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌（SEF101）由佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)實驗室保存，自病例中分離鑒定[7]。

1.2 儀器和試劑 全自動熒光/化學(xué)發(fā)光分析儀(SpectraMax M2e)，美 國 Molecular Devices生 產(chǎn) ；YLN-30電腦控制菌落計數(shù)器，北京亞力恩科學(xué)器材公司生產(chǎn)；PYX-190Z-C震蕩培養(yǎng)箱，廣東韶關(guān)科力實驗儀器有限公司生產(chǎn)；透析袋（截留分子量14 000），上海源聚生物科技有限公司提供；葡萄球菌腸毒素SET檢測試劑盒，上海博舜生物科技有限公司提供。

1.3 金黃色葡萄球菌腸毒素提取和測定 取金黃色葡萄球菌單菌落，接種于腸毒素產(chǎn)毒培養(yǎng)基中，依據(jù)金黃色葡萄球菌及其腸毒素檢測方法（GB/T4789.10-2003）中的液體透析培養(yǎng)法[8]，置通過充補(bǔ)氮氣和加脫氧劑的方法控制空氣中含氧量的密閉培養(yǎng)裝置中搖振(100 r/min)培養(yǎng)，定時對透析袋外的培養(yǎng)液用全自動熒光/化學(xué)發(fā)光分析儀進(jìn)行SE含量測定（本研究所測腸毒素為A-E混合體），吸取培養(yǎng)液后重新調(diào)整裝置中空氣含氧量至設(shè)置水平。

1.4 腸毒素較優(yōu)制備條件的單因素試驗

1.4.1 培養(yǎng)溫度對產(chǎn)量的影響 調(diào)整培養(yǎng)裝置中空氣含氧量為14.5%，分別于25℃、30℃、35℃、40℃、45℃培養(yǎng)40 h，測定培養(yǎng)液中SE的含量。

1.4.2 含氧量對產(chǎn)量的影響 設(shè)定培養(yǎng)溫度為35℃，依據(jù)動態(tài)測量含氧量小于±0.5%進(jìn)行控制，使整個實驗過程的平均含氧量接近所設(shè)定12.5%、13.5%、14.5%、15.5%、16.5%環(huán)境中培養(yǎng)40 h，測定培養(yǎng)液中SE的含量。

1.4.3 產(chǎn)毒培養(yǎng)時間對產(chǎn)量的影響 設(shè)定培養(yǎng)溫度為35℃，空氣含氧量為14.5%的環(huán)境中分別培養(yǎng)20、30、40、50、60 h，測定培養(yǎng)液中SE的含量。

1.5 腸毒素制備條件的正交試驗 將培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)環(huán)境空氣含氧量和產(chǎn)毒培養(yǎng)時間作為因素，按照單因素試驗結(jié)果，選取產(chǎn)量最多的水平進(jìn)行組合，3個因素的3個水平（表1）共同作用，觀察SE產(chǎn)生情況。

表1 正交試驗因素與水平

1.6 金黃色葡萄球菌產(chǎn)SE的特性觀察 質(zhì)控金黃色葡萄球菌（ATCC 25923-3）和產(chǎn)SE金黃色葡萄球菌（SEF101）分別在最優(yōu)工藝條件下培養(yǎng)，每隔2 h對透析袋外的培養(yǎng)液用全自動熒光/化學(xué)發(fā)光分析儀進(jìn)行SE含量測定，觀察金黃色葡萄球菌產(chǎn)SE的規(guī)律。

2 結(jié)果和分析

2.1 腸毒素較優(yōu)制備條件的單因素試驗結(jié)果

2.1.1 培養(yǎng)溫度對SE產(chǎn)量影響的結(jié)果 培養(yǎng)裝置中空氣含氧量為14.5%培養(yǎng)40 h，于25℃～40℃時培養(yǎng)液中SE的含量呈上升的趨勢，40℃達(dá)最大值，40℃～45℃呈下降的趨勢（圖1），溫度對金黃色葡萄球菌產(chǎn)生腸毒素有較大影響，40℃的環(huán)境有利于金黃色葡萄球菌產(chǎn)生SE。

2.1.2 含氧量對SE產(chǎn)量影響的結(jié)果 于35℃培養(yǎng)40 h，空氣含氧量為13.5%～14.5%時培養(yǎng)液中SE的含量呈上升的趨勢，14.5%～17.5%時呈下降的趨勢（圖2），環(huán)境中空氣含氧量對SE產(chǎn)生有明顯影響，含氧量太高或過低均不利于金黃色葡萄球菌產(chǎn)生SE，空氣含氧量為14.5%時有利于金黃色葡萄球菌產(chǎn)生SE。

2.1.3 產(chǎn)毒培養(yǎng)時間對SE產(chǎn)量影響的結(jié)果 空氣含氧量為14.5%，培養(yǎng)溫度為35℃，培養(yǎng)時間為0～40 h時培養(yǎng)液中SE的含量呈快速上升的趨勢，40～60 h培養(yǎng)液中SE的含量增長緩慢趨于穩(wěn)定（圖3），表明培養(yǎng)40 h后金黃色葡萄球菌基本停止產(chǎn)生SE。

2.2 腸毒素制備條件的正交試驗結(jié)果 從表2正交試驗結(jié)果的極差分析得出3個因素對試驗結(jié)果的影響程度為：產(chǎn)毒培養(yǎng)時間＞產(chǎn)毒培養(yǎng)溫度＞環(huán)境中氧含量，其中產(chǎn)毒培養(yǎng)時間這個因素對本試驗最為重要，在本次3因素3水平正交試驗設(shè)計中，其優(yōu)方案為A3B2C2，即采用產(chǎn)毒培養(yǎng)時間40 h，培養(yǎng)溫度40℃，環(huán)境中氧含量15.5%的條件下，SE產(chǎn)量最大，高達(dá)59.31 mg。該試驗結(jié)果和其他正交處理間差異顯著，故產(chǎn)毒培養(yǎng)時間40 h，培養(yǎng)溫度40℃，環(huán)境中氧含量15.5%為本次正交試驗中的最優(yōu)條件。

表2 金黃色葡萄球菌產(chǎn)SE的正交試驗

2.3 金黃色葡萄球菌產(chǎn)SE曲線測定 根據(jù)國標(biāo)（GB/T4789.10-2003）規(guī)定方法在控制空氣含氧量和設(shè)定溫度的條件下，在最優(yōu)工藝條件下培養(yǎng)質(zhì)控金黃色葡萄球菌（ATCC 25923-3）和產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌（SEF101），通過觀察圖4可知，培養(yǎng)6 h培養(yǎng)液即可檢測到SE存在，之后進(jìn)入一個緩慢增加的過程直至16 h，接著16～40 h為金黃色葡萄球菌提取液SE含量快速增加過程，40～60 h為穩(wěn)定期，SE含量增加不明顯（圖4）。質(zhì)控金黃色葡萄球菌（ATCC 25923-3）和產(chǎn)SE金黃色葡萄球菌（SEF101）SE含量變化情況未見明顯差異。

3 討論

通過單因素試驗和正交試驗得到金黃色葡萄球菌SE產(chǎn)量最大的最優(yōu)工藝條件。產(chǎn)毒培養(yǎng)40 h，培養(yǎng)溫度為40℃，環(huán)境中氧含量15.5%的條件下，SE產(chǎn)量最大，單個菌落SE產(chǎn)量為59.31 mg，3個因素對SE產(chǎn)量的影響程度為：產(chǎn)毒培養(yǎng)時間＞產(chǎn)毒培養(yǎng)溫度＞環(huán)境中氧含量，其中產(chǎn)毒培養(yǎng)時間對本試驗最為重要，在合適的環(huán)境氧含量條件下選擇適宜的溫度可促進(jìn)SE的產(chǎn)生。金黃色葡萄球菌產(chǎn)SE曲線表明，培養(yǎng)6～8 h即可檢測到SE的存在，但在40 h后培養(yǎng)液中SE的含量不再明顯增加。因此，作為SE快速檢測，使用全自動熒光/化學(xué)發(fā)光分析儀最快可在在6～8 h給出確切判斷。

SE作為一種抗腫瘤生物制劑，具有良好的應(yīng)用前景，獲得大量純度高成分清晰的SE是它的前題，而本研究結(jié)果表明，金黃色葡萄球菌在合適的溫度和氧含量條件下，培養(yǎng)40 h即可得到SE最大產(chǎn)量。李獻(xiàn)和馬家斌及林新堅等[9]發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌臨床分離株在蘑菇罐頭中生長良好，當(dāng)菌數(shù)達(dá)到107 CFU/mL時即可檢測出SE，隨后大量積累，培養(yǎng)18 h及以各階段SE檢測結(jié)果均為陽性，這與本研究結(jié)果基本一致。

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[8]GB/T4789.10-2003.食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗金黃色葡萄球菌檢驗國家標(biāo)準(zhǔn)[S].

[9]林新堅，陳濟(jì)深，楊佩玉，等.蘑菇罐頭中金黃色葡萄球菌腸毒素研究概況[J].福建農(nóng)業(yè)科技，1994，（5）：23.