臧京帥，高志強(qiáng)，張樂萃，張鶴曉

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島 266109；2.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局，北京 朝陽 100026）

水皰性口炎（Vesicular stomatitis,VS）是由水皰性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus,VSV）引起的動(dòng)物病毒性傳染病，VSV可感染馬及其他多種動(dòng)物，其中馬的易感性最強(qiáng)。其臨床特征為短期發(fā)熱，口腔黏膜、乳頭上皮、趾間及蹄冠部出現(xiàn)丘疹和水皰[1]。人偶發(fā)感染，以流感癥狀為主。水皰性口炎病毒屬于彈狀病毒科水皰性病毒屬，為負(fù)鏈RNA有囊膜病毒。根據(jù)病毒的抗原性，可將VSV分成兩個(gè)血清型，即新澤西型（VSV-NJ）和印第安那型（VSV-IND）；但這2個(gè)血清型的病毒在結(jié)構(gòu)基因組成、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和病毒蛋白等方面均相同[2]。由于我國還沒有該病發(fā)生和流行的報(bào)道，故將其列為外來病，在進(jìn)出境動(dòng)物檢疫對(duì)象中被列為二類病。該病毒是通過糖蛋白G吸附于敏感細(xì)胞表面受體磷酰絲氨酸（PS）而開始感染。如果利用蛋白酶去掉G蛋白，可使病毒的感染性大幅度降低，但一旦將完整的G蛋白重新加入無包膜突起的病毒粒子中，又可恢復(fù)其感染性[3]。

在進(jìn)出口動(dòng)物檢疫中，對(duì)于水皰性口炎病毒抗體檢測，目前采用的方法為中和試驗(yàn)（VN），液相阻斷ELISA（LP-ELISA）和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CF）。其中VN生物安全要求較高，且檢測周期長；LP-ELISA和CF操作相對(duì)繁瑣。由于VSV-NJ和VSVIND僅有部分交叉反應(yīng)，因此在采用LP-ELISA檢測抗體時(shí)需要將兩種血清型的抗原等量混合后檢測抗體。

本研究在對(duì)VSV-IND和VSV-NJ的G蛋白抗原性進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，選取抗原表位較密集且交叉性較多的區(qū)域，利用大腸桿菌體外分別表達(dá)兩個(gè)血清型的G-657 bp和G-666 bp基因片段，將表達(dá)純化的蛋白等量混合后建立間接ELISA方法檢測水泡性口炎病毒抗體。

1 材料與方法

1.1 試劑 TRIZol，購自Invitrogen公司；DNA片段回收試劑盒，限制性內(nèi)切酶Bam HI，Hind III，購自TaKaRa公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，Taq DNA聚合酶，購自Promega公司；HRP標(biāo)記的Protein G，購自SouthernBiotech公司。

1.2 病毒核酸、質(zhì)粒、宿主菌及血清 VSV-IND G6R mutant株病毒核酸，本實(shí)驗(yàn)室保存；VSV NJ株病毒核酸，美國NVSL提供；原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a，大腸桿菌（E.coli）TOP10，Rosetta，本實(shí)驗(yàn)室保存；IND型、NJ型水皰性口炎中和抗體陽性血清，美國NVSL提供。

1.3 水皰性口炎病毒IND型和NJ型G蛋白截短后基因擴(kuò)增、克隆 根據(jù)已知序列，用DNAStar分析VSV-IND和VSV-NJ G蛋白，根據(jù)其抗原表位分布，選取了長度為657 bp和666 bp的兩段基因片段，分別命名為IND-G-657和NJ-G-666，并在其兩端利用Oligo 6.0設(shè)計(jì)以下兩對(duì)引物，設(shè)計(jì)的引物名稱、序列見表1。

表1 用于擴(kuò)增VSVIND-G-657和NJ-G-666的引物名稱和序列

將VSV-IND株和VSV-NJ株核酸分別進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增的目的片段克隆于pMD-T20載體并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TOP10中，將鑒定正確的陽性克隆子進(jìn)行測序，分別命名為pMD-T20-INDG657和pMD-T20-NJ-G666。

1.4 原核表達(dá)載體構(gòu)建與序列分析 分別用限制性內(nèi)切酶BamHI，Hind III對(duì)pMD-T20-IND-G657、pMD-T20-NJ-G666以及pET-32a表達(dá)載體37℃雙酶切后與pET-32a表達(dá)載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TOP10。將鑒定為陽性的質(zhì)粒分別命名為pET-32a-IND-G657和pET-32a-NJ-G666。

1.5 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將重組質(zhì)粒pET-32a-IND-G657和pET-32a-NJ-G666分別轉(zhuǎn)化Rosetta宿主菌，加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG，在27℃進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，將表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

1.6 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)優(yōu)化 對(duì)加入IPTG的終濃度、培養(yǎng)溫度及誘導(dǎo)時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.7 包涵體蛋白的洗滌與溶解 將包涵體用含2 mol/L尿素的Tris緩沖液進(jìn)行洗滌，重復(fù)兩次后將沉淀用含8 mol/L尿素的Tris緩沖液溶解，進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

1.8 包涵體蛋白的純化、復(fù)性 使用HIS.BIND resin蛋白純化試劑盒在變性條件下進(jìn)行蛋白純化。

1.9 重組蛋白的反應(yīng)原性檢測 將純化蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，進(jìn)行電轉(zhuǎn)印。轉(zhuǎn)印結(jié)束，分別用VSV-IND、VSV-NJ中和抗體陽性血清以及HRP標(biāo)記的蛋白G進(jìn)行Western-blot檢測。

1.10 重組間接ELISA方法的建立 將純化的VSV-IND和VSV-NJ重組蛋白等量混合后，按照ELISA方法建立的常規(guī)程序，對(duì)方法建立過程中的各個(gè)條件進(jìn)行了優(yōu)化和確定。

1.11 間接ELISA方法特異性試驗(yàn) 以最適濃度等量混合的抗原包被酶標(biāo)板，分別對(duì)VSV-IND陽性血清、VSV-NJ陽性血清、東部馬腦脊髓炎陽性血清、西部馬腦脊髓炎陽性血清、委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎陽性血清以及馬西尼羅病毒陽性血清作1∶100稀釋，作ELISA測定，驗(yàn)證該方法的特異性。

1.12 板內(nèi)和板間重復(fù)性試驗(yàn) 用重組蛋白包被ELISA板，對(duì)2份陽性血清和2份陰性血清樣品進(jìn)行檢測，重復(fù)4孔，進(jìn)行板內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)；用重組蛋白分別包被4塊反應(yīng)板，分別對(duì)2份陽性血清和2份陰性血清進(jìn)行板間重復(fù)性試驗(yàn)。

1.13 對(duì)已知中和效價(jià)抗血清的檢測 對(duì)中和效價(jià)均為1∶64的VSV-IND和VSV-NJ陽性血清從1∶4開始作2倍系列稀釋至1∶64，用建立的方法作ELISA檢測，用OD值對(duì)稀釋度對(duì)數(shù)進(jìn)行線性回歸。

1.14 對(duì)臨床樣品的檢測 用建立的間接ELISA方法檢測了VSV陰性馬血清樣品184份和已知中和抗體效價(jià)的VSV-IND和VSV-NJ陽性血清各2份。

2 結(jié)果

2.1 VSV病毒兩血清型截短的G蛋白基因片段擴(kuò)增結(jié)果 IND型和NJ型水泡性口炎病毒截?cái)嗟腉蛋白基因擴(kuò)增結(jié)果，電泳結(jié)果顯示，PT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)期結(jié)果一致，分別為657 bp和666 bp（見圖1）。

2.2 IND型水皰性口炎病毒G657、NJ型水皰性口炎病毒G666原核表達(dá)載體的構(gòu)建與序列測定分析 將RT-PCR產(chǎn)物克隆至pMD-T20載體后，通過BamHI、Hind III雙酶切和T4連接酶的連接，成功將目的片段分別構(gòu)建到表達(dá)載體pET-32a上，測序結(jié)果表明，插入的IND-G-657和NJ-G-666基因的重組質(zhì)粒序列與GenBank中基因序列一致，方向和位置與預(yù)期結(jié)果一致。

2.3 IND型和NJ型水皰性口炎病毒截?cái)嗟腉蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將重組質(zhì)粒pET-32a-IND-G657和pET-32a-NJ-G666轉(zhuǎn)化Rosetta宿主菌后。經(jīng)摸索，確定在37℃培養(yǎng)至OD600達(dá)0.6左右，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，27℃繼續(xù)培養(yǎng)5 h，此條件下表達(dá)量較大。結(jié)果見圖2和圖3，誘導(dǎo)后5 h，可觀察到分子量約為30 kDa的重組蛋白。

2.4 重組蛋白的表達(dá)條件優(yōu)化 經(jīng)研究確定的最佳表達(dá)條件為在菌液OD600nm=0.6時(shí)，用1 mmol/LIPTG在27℃誘導(dǎo)5 h，可產(chǎn)生部分可溶性表達(dá)，但大部分目的蛋白為包涵體表達(dá)，但極易溶于2 mol/L尿素中。

2.5 重組蛋白的反應(yīng)原性檢測 進(jìn)行Westernblot檢測，可以檢測到約30 kDa大小的預(yù)期條帶，結(jié)果見圖4。表明重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性。2.6 重組ELISA方法的建立 經(jīng)對(duì)ELISA建立過程中的各個(gè)條件進(jìn)行優(yōu)化結(jié)果如下：抗原最佳包被濃度為0.24 μg，血清最佳稀釋度為1∶100時(shí)；最佳包被條件為37℃作用2 h，然后4℃過夜；最佳封閉液為含1%卵清蛋白的PBST。

經(jīng)對(duì)30份VSV陰性血清進(jìn)行測定，確定樣本臨界值為0.3。

2.7 特異性交叉反應(yīng)試驗(yàn) 結(jié)果表明，除VSV IND型和NJ型陽性血清結(jié)果為陽性外，其他病毒血清和陰性對(duì)照血清的OD450nm值均小于0.3，為陰性。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 對(duì)于4份血清樣品，板內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)最大為3.24%，小于5%；板間重復(fù)試驗(yàn)的變異系數(shù)最大為9.84%，小于10%。

2.9 對(duì)已知中和效價(jià)抗血清的檢測 線性回歸結(jié)果見圖5和圖6。已知中和抗體效價(jià)的血清稀釋度的對(duì)數(shù)與OD450的平均值的對(duì)數(shù)呈線性相關(guān)，R2分別為0.996和0.998，進(jìn)一步說明建立的方法可用于VSV中和抗體的檢測。

2.10 對(duì)臨床樣品的檢測 用建立的間接ELISA方法和中和試驗(yàn)方法檢測了VSV陰性馬血清樣品184份和已知中和抗體效價(jià)的VSV-IND陽性血清和VSV-NJ陽性血清各2份，其檢測結(jié)果一致。

3 結(jié)論與討論

在本研究中,用分子生物學(xué)軟件分析水皰性口炎病毒印第安那型（IND型）和新澤西型（NJ型）G蛋白抗原表位分布，在抗原表位較密集的區(qū)域設(shè)計(jì)引物，采用RT-PCR方法分別擴(kuò)增水皰性口炎病毒IND型657 bp G蛋白基因片段和NJ型666 bp G蛋白基因片段，并將其克隆到pET-32a表達(dá)載體。對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行純化及Western-blot檢測驗(yàn)證正確后，將2個(gè)血清型的重組G蛋白等量混合作為檢測抗原包被酶標(biāo)板，建立了可檢測IND型和新澤西NJ型水皰性口炎病毒抗體的間接ELISA方法。

ELISA方法具有特異、敏感、重復(fù)性好以及易于操作等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛用于多種動(dòng)物傳染病的檢測。本研究利用原核表達(dá)的重組蛋白建立了同時(shí)檢測水皰性口炎病毒IND型和NJ型兩種血清型抗體的間接ELISA方法，并通過試驗(yàn)表明，重組蛋白與VSV IND型和NJ型兩種血清特異性反應(yīng)均良好，可以用于水皰性口炎病毒的IND型和NJ型的檢測。進(jìn)一步收集更多數(shù)量的血清對(duì)我們的方法進(jìn)行驗(yàn)證和完善，將是我們今后的重要任務(wù)。

[1]殷震，劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社，1997.

[2]周學(xué)章，高豐，趙文斌.動(dòng)物水泡性口炎病毒的抗原性[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，15(2):68-72

[3]Schmidtmanm E T，Tabachnick W J.Epizootic of vesicular stomatitis in the western united states[J].J Med Entoma，1999，36(1):71 991-71 995.