武桂梅，劉純德，王振輝?，慈洪波，劉 軍

（1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院制藥工程學(xué)院，吉林吉林132101；2.吉林市吉化江城油脂化工有限公司，吉林吉林132012；3.吉林正業(yè)生物制品股份有限公司，吉林吉林132101）

目前，國內(nèi)外礦物白油乳劑滅活疫苗在注射過程中出現(xiàn)黏稠度較大、注射困難、毒副反應(yīng)較強(qiáng)（過敏）、引起注射部位紅腫、化膿等現(xiàn)象，這與白油佐劑的質(zhì)量有一定相關(guān)性［1］。 Fukanoki［2-3］等用 3 種餾分分布各不相同的礦物油制備的新城疫和傳染性支氣管炎疫苗作了對比實驗，發(fā)現(xiàn)含C20以上餾分較多的礦物油抗體效價較低，而含C16以下餾分較多者副作用比較明顯，而餾分主要集中在C16～C20之間的抗體效價最高而且副作用比較小。鑒于此，課題在前期研究基礎(chǔ)上，以免疫效果較好的進(jìn)口注射用白油的餾分烴類組成及含量為參照依據(jù)，調(diào)整鏈烷烴和環(huán)烷烴的比例，制備出3批注射用白油制品。經(jīng)過免疫效果試驗，對影響注射用白油佐劑免疫效果的因素進(jìn)行分析，為獸用生物制品行業(yè)選用注射用白油，提高油乳劑滅活疫苗免疫效果試驗提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 白油參照品 國內(nèi)白油（20130104GN1、20130203GN2）和進(jìn)口白油（20130301GW1、20130402GW2）各2000 mL，均由吉林市吉化江城油脂化工有限公司提供。

1.2 病毒液與標(biāo)準(zhǔn)血清 合格的新城疫病毒滅活液5000 mL、標(biāo)準(zhǔn)新城疫抗原（20130101）、標(biāo)準(zhǔn)新城疫陽性血清（20130204）、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清（20130101）均由吉林正業(yè)生物制品股份有限公司提供。

1.3 培養(yǎng)基和試劑 硫乙醇酸鹽（T·G）、酪胨瓊脂（G·A）、葡萄糖蛋白胨水（G·P）等常用培養(yǎng)基由學(xué)院生物制藥實驗室制備和保存；吐溫-80、司本-80、硬脂酸鋁，吉林正業(yè)生物制品股份有限公司。

1.4 試驗雞 30日齡SPF雞、未經(jīng)任何疫苗免疫健康的30日齡伊莎褐雛雞，經(jīng)監(jiān)測新城疫血清抗體（HI）低于1∶4，均購于吉林正業(yè)生物制品股份有限公司健康實驗動物中心。

1.5 白油制備 吉林市吉化江城油脂化工有限公司參照國外白油GW1餾分烴類組成及含量，改進(jìn)生產(chǎn)工藝制備不同鏈烷烴和環(huán)烷烴含量的3批白油制品（20130401JH1、20130402JH2、20130403JH3）。

1.6 白油質(zhì)量檢測 吉林市吉化江城油脂化工有限公司按照《中華人民共和國獸藥典》的有相關(guān)規(guī)定方法［4］進(jìn)行。

1.7 白油餾分烴類組成及含量測定 白油樣品餾分烴類組成及含量、正碳數(shù)分布及其含量由吉林化學(xué)工業(yè)公司石油研究院檢測分析。

1.8 新城疫滅活疫苗制備與檢驗 白油樣品按照《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》雞新城疫滅活疫苗制造與檢驗規(guī)程進(jìn)行，分別進(jìn)行油相制備、水相制備，油水比例為2∶1，用小型膠體磨10000 r／min乳化，每個白油樣品制備油乳劑滅活疫苗各2000 mL。每個白油樣品滅活疫苗按照《規(guī)程》標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行物理性狀及黏度檢驗、無菌檢驗、效力檢驗、安全檢驗。

1.9 微量免疫效果試驗 白油樣品新城疫滅活疫苗分別以20μL／只劑量頸部皮下注射 SPF雞 10只，分別于接種免疫后 21、35、49、63、77、91 d 進(jìn)行翅膀下靜脈無菌采血分離血清檢測HI效價［5］。

1.10 高劑量免疫效果試驗 白油樣品新城疫滅活疫苗分別以0.5 mL／只劑量胸部肌肉接種30日齡伊莎褐雛雞30只，分別于接種免疫后15、30、45、60、75、90 d進(jìn)行隨機(jī)抽樣5只，無菌采血分離血清檢測HI效價，剖檢疫苗注射部位，觀察藥物殘留吸收情況［6］。

2 結(jié)果與分析

2.1 白油樣品質(zhì)量檢測結(jié)果 除了酸度、易炭化物、固形石蠟、硫化合物、氣味、顏色（賽氏號）、傾點(diǎn)℃、閃點(diǎn)（開口℃）、折光率（25℃）等數(shù)據(jù)均符合（獸藥典三部）標(biāo)準(zhǔn)外。相對密度、運(yùn)動黏度、稠環(huán)芳烴含量、重金屬含量數(shù)據(jù)見表1。

表1 白油樣品質(zhì)量檢測結(jié)果

從表1可知，運(yùn)動黏度從高到低的順序是GN2＞GN1＞GW1＞JH2＞JH3＞JH1＞GW2；稠環(huán)芳烴含量從高到低的順序是 GN1＞GW2＞JH3＞GN2＞JH1＞JH2＞GW1；重金屬含量超過百萬分之十的是國內(nèi)參考樣品GN1和國外的GW2、GW1參考樣品。

2.2 白油樣品餾分烴類組成及含量分析結(jié)果 見表2。

表2 白油樣品烴類組成及含量分析數(shù)據(jù)表 %

由表2數(shù)據(jù)分析結(jié)果可知：鏈烷烴含量國內(nèi)白油比參照進(jìn)口白油平均低0.1%；一環(huán)烷烴含量國內(nèi)白油比參照進(jìn)口白油平均高4.57%；二環(huán)烷烴含量國內(nèi)白油比參照進(jìn)口白油平均低2.43%；三環(huán)烷烴含量國內(nèi)白油比參照進(jìn)口白油平均低1.42%；總環(huán)烷烴含量國內(nèi)白油比參照平均高0.72%；總飽和烴含量國內(nèi)白油比參照進(jìn)口白油平均高0.62%。雜質(zhì)含量最高的是GW2為3.9、最低的是JH1為0.24，雜質(zhì)含量從高到低的順序是GW2＞GN2＞GW1＞GN1＞JH2＞JH3＞JH1。

2.3 白油樣品主要正碳數(shù)分布分析結(jié)果 見表3。

表3 白油樣品正碳數(shù)分布的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分析數(shù)據(jù)表 %

由表3數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計可知：C12～C15含量國內(nèi)白油比參照進(jìn)口白油平均低1.96%；C16～C20含量國內(nèi)白油比參照進(jìn)口白油平均低13.6%；C21～C26含量國內(nèi)白油比參照進(jìn)口白油平均低0.19%；C12～C26含量國內(nèi)白油比參照進(jìn)口白油平均低15.78%。

2.4 白油樣品制備的滅活疫苗檢驗結(jié)果 見表4。

表4 白油樣品新城疫滅活疫苗制備的檢驗結(jié)果

可以看出，制備的7種滅活疫苗各項檢驗全部合格，其平均免疫抗體高低的順序是JH2＞GW1＞GN2＞JH1＞JH3＞GN1＞GW2。

2.5 微量免疫抗體消長結(jié)果 不同免疫日齡HI抗體幾何平均效價消長檢測結(jié)果見圖1。

由圖1抗體消長數(shù)據(jù)曲線可知：國內(nèi)白油和進(jìn)口白油樣品佐劑效果差異較大，免疫至91天時，白油樣品JH2平均血清抗體最高為26.95，白油樣品JH3平均血清抗體最低為25.82，白油樣品平均血清抗體消長數(shù)據(jù)高低的順序是JH2＞GW1＞GN2＞GN1＞JH1＞GW2＞JH3。

2.6 高劑量免疫抗體消長結(jié)果 不同免疫日齡HI抗體幾何平均效價消長監(jiān)測結(jié)果見圖2。

由圖2抗體消長數(shù)據(jù)曲線可知：國內(nèi)白油和進(jìn)口白油樣品佐劑效果差異較大，免疫至90天時，白油樣品JH2平均血清抗體最高為28.63，白油樣品JH3平均血清抗體最低為27.77，白油樣品平均血清抗體消長數(shù)據(jù)高低順序是 JH2＞GW1＞JH1＞GN1＞ GN2＞GW2＞JH3。

圖1 白油樣品滅活疫苗20 μL免疫血清抗體效價消長曲線

圖2 白油樣品滅活疫苗0.5 mL免疫血清抗體消長曲線

2.7 高劑量免疫注射部位剖檢藥物殘留量結(jié)果不同免疫日齡藥物殘留量結(jié)果見表5。

表5 白油樣品新城疫滅活疫苗注射部位剖檢藥物殘留量結(jié)果

從表5結(jié)果看出，不同免疫日齡藥物吸收與殘留的情況各不相同，白油佐劑吸收快，殘留量由少到多的順序是 GN2＞JH3＞JH2＞GW1＞JH1＞GN1＞GW2。綜合微量免疫和高劑量免疫抗體效價消長檢測結(jié)果，以及注射部位剖檢藥物殘留情況，白油樣品佐劑免疫效果高低的順序是JH2＞GW1＞JH1＞GN2＞GN1＞GW2＞JH3。

3 討論

目前，研究礦物白油佐劑免疫效果的文獻(xiàn)報道不多，最適用的研究方法是制備新城疫滅活疫苗或禽流感滅活疫苗免疫健康雞，采用血凝抑制試驗檢測血清抗體效價，剖檢注射部位，觀察藥物殘留吸收情況，對分析影響礦物白油佐劑免疫效果的因素，及篩選免疫效果較好的礦物白油是必不可少的的試驗方法。

如果礦物油精制深度不夠，多環(huán)芳烴的含量就會超過殘留限量，動物免疫后殘留在畜禽體內(nèi)造成潛在的食品安全問題［7］。通過對白油樣品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測數(shù)據(jù)分析，國內(nèi)白油樣品GN1稠環(huán)芳烴和重金屬含量超標(biāo)，國外白油樣品GW2、GW1重金屬含量超標(biāo)。通過對白油樣品的烷基苯、總單環(huán)芳烴、苊烯類、三環(huán)芳烴、總雙環(huán)芳烴等雜質(zhì)含量檢測數(shù)據(jù)分析，雜質(zhì)含量最高的是國外白油樣品GW2，其次是國內(nèi)白油樣品GN1；三環(huán)芳烴含量最高的是國內(nèi)白油樣品GN1，總芳烴含量最高的是國外白油樣品GW2。通過白油樣品雜質(zhì)含量數(shù)據(jù)分析結(jié)合免疫效果，不難看出影響注射用礦物白油佐劑免疫效果的主要因素是雜質(zhì)含量。

按照文獻(xiàn)“餾分主要集中在C16～C20之間的抗體效價最高而且副作用比較小［2］”的報道，白油樣品正碳數(shù)在C16～C20分布比例差異較大：國外白油樣品GW2比例最高為29.54%，其次是國外白油樣品GW1為7.74%，最低的是國內(nèi)白油樣品GN1為3.63%，其他國內(nèi)白油樣品在5.50%左右。試驗表明免疫效果較好的是試制白油樣品JH2，而國外白油樣品GW2免疫效果與文獻(xiàn)報道并不相符，有待進(jìn)一步研究分析。

白油的運(yùn)動黏度與密度直接相關(guān)，主要是由鏈烷烴含量、環(huán)烷烴含量、碳數(shù)分布情況及其分子量大小決定的。2010年版《獸藥典》修訂的注射用白油運(yùn)動黏度為7～13 mm2／s，目前很多獸用滅活疫苗生產(chǎn)廠家普遍使用的白油運(yùn)動黏度為4～7 mm2／s。試驗分析國內(nèi)白油樣品GN1運(yùn)動黏度較高為7.31 mm2／s，制備的滅活疫苗的黏度相對大些，免疫注射困難、吸收降解慢，殘留量多些；而國外白油樣品GW2的運(yùn)動黏度較小為4.38 mm2／s，制備的滅活疫苗的黏度相對小些，免疫注射好，但應(yīng)激性大，殘留量大，抗體消長起伏波動大，因而運(yùn)動黏度也是影響白油免疫效果的一個因素。參照“疫苗中白油佐劑對雞群影響較小，增重高于其他各組，疫苗吸收速度快，注射省力，抗體水平優(yōu)秀，確定為最佳白油佐劑［8］”的標(biāo)準(zhǔn)，試驗制備的白油樣品JH2免疫效果較好，其運(yùn)動黏度、烴類組成與含量、碳數(shù)分布等參數(shù)具有一定參考作用。

注射白油和油乳劑疫苗均影響了肉雞血清蛋白和甘油三酯的合成與代謝，同時在一定程度上劣化了雞肉品質(zhì)，其作用機(jī)理還待進(jìn)一步研究［8］。如何深入研究礦物白油哪些成份與免疫佐劑效果直接相關(guān)，哪些成份與免疫毒副作用直接相關(guān)，制備出免疫效果優(yōu)良，無毒副作用礦物白油佐劑，提高動物安全生產(chǎn)，提高動物性食品安全，是一項重要的研究課題。

［1］何海蓉，姜 平，梅 忠，等.不同來源白油佐劑質(zhì)量分析及其制備的禽流感疫苗安全性與免疫效力研究［J］.中國家禽，2009， 31（22）： 15-18.

［2］李 芳，張 榮，單 虎，等.油佐劑研究進(jìn)展與質(zhì)量監(jiān)控［J］.中國動物檢疫，2010，27（12）：70-71.

［3］Fukanoki S，Matsumoto K，Mori H，et al.Effect of liquid paraffin on antibody responses and local adverse reactions of bivalent oil adjuvanted vaccines containing newcastledisease virusand infectious bronchitis virus［J］.J Vet Med Sci， 2000， 62（12）：1317-1319.

［4］中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典三部［S］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2010：51-53.

［5］中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000：83-85.

［6］王振輝，慈洪波，武桂梅，等.不同來源注射用白油佐劑佐劑免疫效果分析［J］.中國家禽， 2013，35（19）： 48-50.

［7］陳世豪，郝同楊，施祖灝，等.油乳佐劑及其安全性研究進(jìn)展［J］.中國家禽，2013，35（16）：44-46.

［8］叢秋實，胡瑞鴻，鄭德富，等.禽流感（H9）滅活疫苗白油佐劑的優(yōu)選試驗［J］.中國動物保健， 2013，15（10）： 17-19.

［9］陳世豪，施祖灝，郝同楊，等.白油佐劑對肉雞血清生化指標(biāo)及雞肉品質(zhì)的影響［J］.中國畜牧雜志，2013，49（23）：76-78.