高 艷 孫 靜 高玉光 郭晶晶 王青山

牙周病是危害人類口腔健康的主要疾病之一，是成人失牙的主要原因。牙周病的發(fā)生、發(fā)展及治療轉(zhuǎn)歸與全身及局部多種因素密切相關(guān)。研究表明，神經(jīng)因素對牙周病的發(fā)生、發(fā)展及組織修復(fù)有重要的影響，但其作用機(jī)制并不清楚。以失神經(jīng)支配的牙周炎動物模型來研究兩者之間的關(guān)系是目前較為理想的研究方法。在本課題前期研究中，成功利用絲線結(jié)扎加高糖飲食的方法建立了失神經(jīng)支配下的大鼠牙周炎實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚1]。本實(shí)驗(yàn)比較了采用不同材質(zhì)的結(jié)扎絲在建立牙周炎動物模型中的優(yōu)劣，探討一種更快速、更有效的建立失神經(jīng)支配的牙周炎動物模型的方法。

1.材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 80只2月齡SPF級體重300±25g Wistar雄性大鼠(山東大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供)。隨機(jī)分為5組，每組16只，即假手術(shù)組(N)、離斷下牙槽神經(jīng)+絲線結(jié)扎(P1)組、離斷下牙槽神經(jīng)+正畸結(jié)扎絲結(jié)扎(P2)組、單純絲線結(jié)扎(P3)組、單純離斷下牙槽神經(jīng)(P4)組。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 大鼠稱重后，10%水合氯醛按0.4ml/100g劑量腹腔麻醉，15-30#K型根管銼依次適當(dāng)擴(kuò)大左側(cè)下頜第一磨牙與第二磨牙之間牙間隙，剝離牙齦。P1組雙股3-0絲線結(jié)扎左側(cè)第一磨牙，并將結(jié)扎線盡量置于齦溝內(nèi)，暴露并離斷同側(cè)下牙槽神經(jīng)[1]，術(shù)后高糖飼料和200g/L高糖水進(jìn)行喂養(yǎng)[2]；P2組用直徑為0.25mm的正畸結(jié)扎絲結(jié)扎左側(cè)第一磨牙牙頸部，離斷同側(cè)下牙槽神經(jīng)，術(shù)后高糖飲食喂養(yǎng)；P3組僅用雙股絲線結(jié)扎左側(cè)第一磨牙，術(shù)后高糖飲食喂養(yǎng)；P4組僅離斷左側(cè)下牙槽神經(jīng)而不結(jié)扎第一磨牙，術(shù)后常規(guī)鼠糧和水喂養(yǎng)；N組暴露但不離斷神經(jīng)，術(shù)后常規(guī)喂養(yǎng)。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 大體觀察 在1周、2周、4周、6周分別對牙齦指數(shù)、出血指數(shù)、牙齒松動度、牙槽骨吸收情況、牙齦退縮的程度及牙周袋深度進(jìn)行檢測。

1.3.2 針刺實(shí)驗(yàn) 在各時間段對大鼠左側(cè)下頜區(qū)域行針刺實(shí)驗(yàn)，測定下牙槽神經(jīng)功能。

1.3.3 X線檢查 在各時間段分別用新鮮配制4%多聚甲醛溶液行心臟體外循環(huán)內(nèi)灌注，初步固定后，分離其下頜骨并截取磨牙段，拍攝X線片。

1.3.4 組織病理學(xué)觀察 標(biāo)本用100mL/L甲醛液固定6h，15%EDTA脫礦，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片厚5μm，常規(guī)HE染色，光鏡觀察。

2.結(jié)果

2.1 大體觀察 術(shù)后約2-3h后蘇醒。術(shù)后1-2d，實(shí)驗(yàn)動物少量進(jìn)食，厭活動。3-4d后漸漸恢復(fù)正常。創(chuàng)口愈合良好，無感染，無一意外死亡。

2.1.1 P1組 1周時，大鼠進(jìn)食減少，體重下降，絲線周圍食物及軟垢滯留量多，無松動脫落現(xiàn)象；牙齦退縮，探診出血，根分叉區(qū)暴露，牙齒Ⅰ度松動。2周時，牙齦退縮明顯，根分叉暴露，與對側(cè)呈貫通狀吸收，牙齒Ⅲ度松動。結(jié)扎4周，牙齦從牙面剝離，質(zhì)地松軟，探針出血明顯，有牙周溢膿傾向。牙齦退縮至根尖1/3處，牙根暴露處有牙石形成。結(jié)扎6周，牙齦退縮嚴(yán)重，炎癥充血不明顯，牙根周圍有牙石形成。

2.1.2 P2組 結(jié)扎1周，左側(cè)下頜下緣傷口處愈合良好，結(jié)扎絲無松動及脫落現(xiàn)象，牙齦充血、水腫，輕度退縮。結(jié)扎2周，牙齦水腫，色澤暗紅，齦溝加深，鋼絲結(jié)扎打結(jié)處有輕微齦增生。結(jié)扎4周,炎癥、水腫十分嚴(yán)重，牙齦從牙面剝離,鋼絲結(jié)扎處形成牙周袋,鋼絲被埋于牙周袋內(nèi)，鋼絲結(jié)扎處牙齦增生明顯。結(jié)扎6周，牙齦嚴(yán)重退縮，呈暗紅色，質(zhì)地松軟，探針出血明顯，根分叉暴露，有牙周溢膿傾向。

2.1.3 P3組 結(jié)扎1周，絲線無松動及脫落現(xiàn)象，周圍有大量食物及軟垢滯留，牙齦水腫、充血，質(zhì)地松軟，根分叉區(qū)暴露。結(jié)扎14d，牙齦退縮至根中1/3處，根分叉暴露，探針可探入根分叉區(qū)，但未與對側(cè)貫通。結(jié)扎4周，絲線結(jié)扎處牙齦增生明顯，根分叉完全暴露，與對側(cè)形成貫通性病變。結(jié)扎6周，牙齦退縮，質(zhì)地松軟，根分叉暴露，有牙石形成。

2.1.4 P4組 大鼠少動，毛色亮且順，左側(cè)下頜下緣傷口處愈合良好，牙齦色形質(zhì)基本正常，無明顯炎癥性改變。進(jìn)食量及體重沒有明顯改變。

2.1.5 N組 大鼠活動正常，左側(cè)傷口愈合良好，牙齦色形質(zhì)正常，進(jìn)食量及體重未見明顯改變。

2.2 針刺實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在術(shù)后不同時間段用大頭針刺大鼠雙側(cè)下頜區(qū)域，左側(cè)無逃避反應(yīng)，右側(cè)逃避反應(yīng)明顯。

2.3 X線檢查

2.3.1 P1組 1周時，牙周膜間隙增寬，牙槽嵴頂高度降低，骨白線消失，根分叉區(qū)呈低密度透射影像。2周時，牙槽嵴頂位于根尖1/3處，邊緣模糊，根分叉區(qū)呈透射影像。6周時，牙槽嵴頂位于根尖1/3處，邊緣較清晰，牙周膜間隙明顯增寬，根尖周呈透射影像。

2.3.2 P2組 2周時，牙槽嵴頂約位于根冠1/3處，邊緣模糊，根分叉區(qū)呈完全透射影像。6周時，牙槽嵴頂位于根尖1/3處，牙周間隙增寬，邊緣模糊不清。

2.3.3 P3組 1周時，牙周膜間隙增寬，牙槽嵴頂高度降低，骨白線消失，根分叉區(qū)呈低密度透射影像。2周時，牙槽嵴頂邊緣模糊，根分叉區(qū)呈透射影像。6周時，牙槽嵴頂位于根中1/3處，邊緣較清晰。

2.3.4 P4組 1周時，未有明顯變化。2周時，牙周膜間隙增寬，寬度較均勻。骨白線不清晰，牙槽嵴頂位置未見明顯異常。6周時，牙周間隙明顯增寬，牙槽嵴頂模糊，高度降低，固有牙槽骨密度降低。

2.3.5 N組 1周時，牙周膜間隙寬度均勻一致；牙槽嵴頂位于釉牙本質(zhì)界附近，根分叉區(qū)及牙槽間隔骨質(zhì)密度未見異常。其他時間段X線下觀察牙周組織情況與1周時相比未見明顯異常(圖1)。

2.4 組織病理切片觀察

2.4.1 P1組 結(jié)扎1周，結(jié)締組織內(nèi)炎性細(xì)胞向根方彌漫浸潤，結(jié)合上皮附著位點(diǎn)向根方延伸；牙周韌帶纖維排列紊亂，出現(xiàn)斷裂；牙槽骨高度明顯降低，牙槽窩內(nèi)壁出現(xiàn)大量破骨細(xì)胞及骨吸收陷窩。結(jié)扎2周，牙周膠原纖維破壞,出現(xiàn)斷裂、疏松、變性，排列紊亂，牙周膜間隙增寬；骨吸收陷窩增多。結(jié)扎4周，牙周間隙不規(guī)則增寬，牙槽嵴頂形態(tài)不規(guī)則，有死骨形成。結(jié)扎6周，牙周纖維排列趨于正常，慢性炎性細(xì)胞浸潤，骨吸收陷窩內(nèi)破骨細(xì)胞數(shù)量減少(圖2)。

2.4.2 P2組 結(jié)扎1周,牙齦上皮潰瘍、糜爛，炎癥細(xì)胞浸潤。結(jié)扎2周，結(jié)合上皮增生,釘突向結(jié)締組織深部延伸；結(jié)締組織內(nèi)炎癥細(xì)胞彌漫,毛細(xì)血管擴(kuò)張充血；膠原纖維破壞，排列紊亂。結(jié)扎4周，炎性細(xì)胞向根方彌漫浸潤,結(jié)合上皮附著位點(diǎn)向根方延伸；牙周韌帶纖維排列紊亂，出現(xiàn)斷裂；牙槽窩內(nèi)壁出現(xiàn)骨吸收陷窩及大量破骨細(xì)胞。結(jié)扎6周，牙周膜顯著增寬，纖維排列紊亂，牙槽骨破壞嚴(yán)重，可見纖維性變(圖3)。

2.4.3 P3組 結(jié)扎1周，牙周韌帶纖維排列紊亂,牙槽骨內(nèi)壁形態(tài)變得不規(guī)則。結(jié)扎2周，牙槽骨內(nèi)可見較多的骨吸收陷窩及纖維樣變。結(jié)扎6周，牙周纖維排列趨于正常，牙槽骨高度降低，慢性炎性細(xì)胞浸潤(圖3)。

2.4.4 P4組 各時間段，牙周組織無明顯炎癥反應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)4、6周，牙槽骨骨小梁變細(xì)且較稀疏，血管和淋巴管擴(kuò)張，牙周間隙不規(guī)則增寬(圖 4)。

2.4.5 N組 各時間段牙周組織無明顯變化(圖 5)。

3.討論

牙周病是多因素所致的牙周組織慢性炎癥性破壞性疾病，國內(nèi)外大量研究證實(shí)神經(jīng)因素與牙周炎的發(fā)生發(fā)展和牙周組織的再生修復(fù)密切相關(guān)[3-6]，Zavarella等[7]報(bào)道了1例因顱神經(jīng)損傷導(dǎo)致同側(cè)上下頜嚴(yán)重牙周病的病例，推測支配牙周組織的神經(jīng)損傷和牙周病的發(fā)病密切相關(guān)，但其具體作用及機(jī)制尚不清楚。

圖1 X線檢查圖片

圖2 P1組2周時組織學(xué)觀察

圖3 P2組6周時組織學(xué)觀察(HE，×4)

圖4 P3組6周時組織學(xué)觀察

實(shí)驗(yàn)表明，單純離斷神經(jīng)組(P4組)隨著失神經(jīng)支配時間的延長，牙槽骨的密度和高度較假手術(shù)組(N組)有較明顯的降低，前期研究也表明[8]，下牙槽神經(jīng)缺失能明顯加重牙周支持組織尤其是牙槽骨的破壞，但是單純的神經(jīng)缺失不會形成牙周炎。要深入研究神經(jīng)因素在牙周病發(fā)生發(fā)展及牙周組織再生修復(fù)中的重要作用，需要有穩(wěn)定可靠的動物模型。

圖5 P4組、N組6周時組織學(xué)觀察(HE，×4)

大鼠是一種較為常用的構(gòu)建牙周炎模型的動物[9]，且大鼠的腦神經(jīng)與人類相似，適合用于神經(jīng)和精神性疾病的研究[10]。本實(shí)驗(yàn)采用Wistar雄性大鼠作為動物模型，避免懷孕等對實(shí)驗(yàn)的影響。

本實(shí)驗(yàn)采用了牙頸部結(jié)扎聯(lián)合高糖軟食的方法建立牙周炎動物模型。為了明確不同材質(zhì)結(jié)扎絲對牙周炎的影響，對絲線和正畸用結(jié)扎絲的建模效果進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，結(jié)扎絲不同對牙周組織的刺激不同，相同材質(zhì)結(jié)扎絲，離斷下牙槽神經(jīng)組較未離斷神經(jīng)組嚴(yán)重。絲線結(jié)扎組(P1組)出現(xiàn)的較鋼絲結(jié)扎組(P2組)早且嚴(yán)重，建模效果好。究其原因，可能是絲線比結(jié)扎絲粗糙，吸水后體積有一定的膨脹，自潔作用差，相同喂養(yǎng)條件下，絲線比結(jié)扎絲更容易造成食物及菌斑滯留。程玨[11]等發(fā)現(xiàn)絲線結(jié)扎容易脫落，未能成功誘導(dǎo)出牙周炎模型。在本實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)有絲線脫落的情況，可能與以下因素有關(guān)：(1)在結(jié)扎過程中，用15-30#K型根管銼適當(dāng)擴(kuò)大了鄰間隙，采用這種方法不僅便于絲線結(jié)扎，還不會破壞鄰接關(guān)系，減少了絲線脫落的幾率。同時，在操作過程中對牙周組織形成機(jī)械刺激，有利于菌斑的附著和牙周炎癥的形成。(2)術(shù)后采用軟食和高糖飲水喂養(yǎng)，對絲線的磨損較小，而且高糖軟食能更利于菌斑堆積，更快的形成牙周炎模型。

[1]孫 靜，李 紓，高 艷，等.大鼠下牙槽神經(jīng)離斷和牙周炎雙重動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕J].上海口腔醫(yī)學(xué)，2012，21(1):9-14

[2]蘇 軍，劉魯川，毛永利，等.SD大鼠牙周炎動物模型的建立[J].牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2006，16(11):612-615

[3]F Mignini，M Sabbatini，V D'Andrea，et al.Neuropeptides of human thymus in normal and pathological conditions[J].Peptides，2011，32(5):920-928

[4]Yan XZ，Ge SH，Sun QF，et al.A pilot study evaluating the effect of recombinant human bone morphogenetic protein-2 and recombinant human beta-nerve growth factor on the healing of Class III furcation defects in dogs[J].Periodontol，2010，81(9):1289-1298

[5]Lee HJ，Jeong GS，Pi SH，et al.Heme oxygenase-1 protects human periodontal ligament cells against substance P-induced RANKL expression[J].Periodontal Res，2010，45(3):367-374

[6]徐 娟，胡 敏.神經(jīng)再生在種植體骨感知中的作用[J].中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志，2012，10(4):241-246

[7]Zavarella MM，Leblebicioglu B，Claman LJ，et al.Unilateral severe chronic periodontitis associated with ipsilateral surgical resection of cranial nerves V，VI，and VII[J].J Periodontol，2006，77(1):142-148

[8]高 艷，孫 靜，李 紓，等.離斷下牙槽神經(jīng)對大鼠牙周炎進(jìn)展影響的組織學(xué)改變[J].濱州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，34(6):422-426

[9]Klausen B，Evans RT，Ramamurthy NS，et a1.Periodontal bone level and gingival proteinase activity in gnotobiotic rats immunized with Bacteroides gingivalis[J].Oral Microbiol Immunol，1991，6(4):193

[10]趙光明，陳克敏，柴維敏，等.大鼠三叉神經(jīng)解剖和MR成像[J].生物醫(yī)學(xué)工程與臨床，2007，11(5):348-351

[11]程 玨，李 霞，孫克勤，等.不同方法構(gòu)建大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型的研究[J].中國藥物與臨床，2007，7(9):682-684