徐水清（湖北省咸寧市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 437000）

銅綠假單胞菌是呼吸道感染的重要病原菌之一，屬于條件致病菌，普遍存在于空氣、水、土壤等介質(zhì)中，在正常人皮膚、呼吸道、腸道中有少量存在，對(duì)慢性、彌漫性和擴(kuò)張性支氣管炎的發(fā)病有重要影響［1］。老年患者感染黏液型銅綠假單胞菌有生物膜，能在黏膜表面形成大量多糖藻酸鹽類(lèi)黏液，這是持續(xù)定植、生物膜穩(wěn)固的分子學(xué)結(jié)構(gòu)特征［2］。黏膜表面使得黏液型銅綠假單胞菌對(duì)抗菌藥物的抵抗能力和耐受性增強(qiáng)，增加了菌群檢測(cè)的復(fù)雜性，加大了抗菌治療的難度。因此對(duì)黏液型銅綠假單胞菌耐藥性的檢測(cè)，分析老年患者各種支氣管疾病、肺病等疾病的病因，具有重要的診斷和治療意義［3］。本研究通過(guò)分離老年支氣管炎、慢性阻塞性肺病等患者的黏液型銅綠假單胞菌菌株，進(jìn)行耐藥檢測(cè)和細(xì)菌靈敏性分析，對(duì)不同抗菌藥物的抗黏液型和非黏液型銅綠假單胞菌的耐藥?kù)`敏度進(jìn)行對(duì)比研究，分析黏液型銅綠假單胞菌的耐藥能力和生物學(xué)機(jī)制。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇本院呼吸內(nèi)科2011～2013年因支氣管炎、慢性阻塞性肺病等住院的老年患者200例，其中男82例，女118例；年齡55～85歲，平均年齡（67.0±8.2）歲；患者經(jīng)過(guò)臨床檢查確診為黏液型銅綠假單胞菌感染。通過(guò)對(duì)尿、痰、膿、分泌物等檢測(cè)和分離，對(duì)同一患者反復(fù)檢測(cè)出的同一種菌株只記錄一次結(jié)果。共獲得66株黏液型銅綠假單胞菌。

1.2 方法

1.2.1 抗菌藥物環(huán)丙沙星注射液購(gòu)自浙江亞太藥業(yè)股份有限公司。注射用頭孢哌酮舒巴坦鈉，粉針劑提取物等購(gòu)自浙江亞太藥業(yè)股份有限公司。注射用亞胺培南西司他丁鈉，粉針劑提取物等購(gòu)自美國(guó)梅里埃生物公司。頭孢他啶、頭孢哌酮都購(gòu)自張家口圣大藥業(yè)有限公司。阿米卡星、哌拉西林等均購(gòu)自法國(guó)梅里埃生物制品有限公司。

1.2.2 儀器與試劑 HX－21細(xì)菌鑒定分析儀及相應(yīng)試劑、藥敏紙片等均購(gòu)自合肥恒星科技開(kāi)發(fā)有限公司；哥倫比亞血瓊脂平板、麥康凱平板及Mueller－Hinton（MH）瓊脂平板均購(gòu)自鄭州安圖綠科生物工程有限公司。

1.3 菌株鑒定和檢測(cè)

1.3.1 菌株鑒定按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》［4］對(duì)標(biāo)本菌株進(jìn)行培養(yǎng)、分離、檢測(cè)。在初代菌株培養(yǎng)中，環(huán)境溫度為35℃，時(shí)間為18～24h，介質(zhì)為血平板或麥康凱培養(yǎng)基，無(wú)色透明、水滴樣、邊緣光滑、無(wú)血凝菌落和結(jié)塊。在48h長(zhǎng)成菌株中，大而融合、觸感黏稠成膠凍樣菌落，溶血效果不顯著，接種環(huán)不易分離，氧化酶檢測(cè)部分顯陰性，顯微鏡觀察為革蘭染色陰性桿菌，出現(xiàn)類(lèi)莢膜樣物質(zhì)。黏液型和非黏液型銅綠假單胞菌的區(qū)別在于非黏液型銅綠假單胞菌具有金屬光澤，帶有特殊香味，在實(shí)驗(yàn)室反復(fù)傳代后，能恢復(fù)顯著的菌株特征，具備原始菌株生理學(xué)特征和生物學(xué)生命過(guò)程。而黏液型銅綠假單胞菌實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)結(jié)果與此相反。

1.3.2 菌株檢測(cè)通過(guò)以下藥敏實(shí)驗(yàn)流程圖對(duì)所提取菌株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)。見(jiàn)圖1。

圖1 藥敏實(shí)驗(yàn)流程圖

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黏液型銅綠假單胞菌傳種前后對(duì)不同抗菌藥物的抑菌環(huán)比較黏液型銅綠假單胞菌在傳種前48、72h 不同抗菌藥物中的抑菌環(huán)結(jié)果與傳種后24、48、72h的檢測(cè)結(jié)果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。傳種前24h的檢測(cè)結(jié)果與48、72h以及傳種后24、48、72h 結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 黏液型銅綠假單胞菌傳種前后對(duì)抗菌藥物的耐藥性比較傳種前24h對(duì)6種抗菌藥物的耐藥性與48、72h時(shí)的耐藥性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其他時(shí)候不同抗菌藥物對(duì)傳種前后黏液型銅綠假單胞菌的耐菌檢測(cè)效果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表1 黏液型銅綠假單胞菌傳種前后對(duì)不同抗菌藥物抑菌環(huán)比較（，mm）

表1 黏液型銅綠假單胞菌傳種前后對(duì)不同抗菌藥物抑菌環(huán)比較（，mm）

注：與傳種前24h時(shí)測(cè)量結(jié)果比較，aP＜0.05。

表2 黏液型銅綠假單胞菌傳種前后對(duì)抗菌藥物的耐藥性比較（%）

2.3 黏液型銅綠假單胞菌對(duì)抗菌藥物敏感性分析黏液型銅綠假單胞菌對(duì)β－內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物、頭孢類(lèi)抗菌藥物、頭孢哌酮舒巴坦鈉和哌拉西林敏感性較高，均在90%以上。見(jiàn)表3。

表3 黏液型銅綠假單胞菌對(duì)抗菌藥物敏感性分析（%）

3 討論

老年黏液型銅綠假單胞菌是慢性呼吸道感染主要病原菌，由于存在黏液阻滯細(xì)菌生長(zhǎng)，使此菌株生長(zhǎng)速度小于常規(guī)水平，因此在培養(yǎng)24h 后才能發(fā)現(xiàn)抑菌環(huán)直徑大小有顯著改變［5］。本研究結(jié)果顯示，24h抑菌環(huán)直徑大小和48h的檢測(cè)結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。可見(jiàn)，48h時(shí)檢測(cè)對(duì)菌群鑒別的準(zhǔn)確性有重要意義。因此，在老年感染黏液型銅綠假單胞菌的藥敏檢測(cè)中，應(yīng)將檢測(cè)報(bào)告控制在48h，以保證菌群檢出陽(yáng)性率，為臨床診斷和疾病治療提供準(zhǔn)確依據(jù)［6］。

本研究結(jié)果顯示，傳種前菌株對(duì)不同抗菌藥物在24h的抑菌環(huán)直徑結(jié)果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而24h與48、72h的檢測(cè)結(jié)果比較，差異卻有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說(shuō)明24h內(nèi)藥敏檢測(cè)結(jié)果存在漏洞，對(duì)24～48h內(nèi)的菌群變化容易產(chǎn)生錯(cuò)誤判斷［7］。細(xì)菌在抗菌藥物抑制環(huán)境中為求生存，產(chǎn)生黏附于組織或其他物質(zhì)表面的分泌多糖（藻酸鹽、纖維蛋白、多糖等），使細(xì)菌相互粘連形成菌膜，因此出現(xiàn)耐藥?kù)`敏度不同的現(xiàn)象。為此，通過(guò)進(jìn)一步對(duì)傳種n代后不同時(shí)間點(diǎn)的MIC進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果與傳種前的48、72h檢測(cè)結(jié)果相似，這可能從一定程度上解釋了敏感抗菌藥物的耐藥性檢測(cè)報(bào)告失準(zhǔn)性和抗菌藥物抗菌效果不佳的問(wèn)題。因此，將藥敏檢測(cè)報(bào)告控制在48h，對(duì)患者機(jī)體菌群水平耐藥性判斷和抗菌藥物臨床用藥依據(jù)具有衡量評(píng)價(jià)意義。

通過(guò)研究可知，黏液型銅綠假單胞菌在48h后達(dá)到與消除黏液型銅綠假單胞菌24、48、72h檢測(cè)效果相同的程度，說(shuō)明黏液的存在對(duì)菌株的耐抗菌藥物效應(yīng)影響極大。這個(gè)結(jié)論可以在一定程度上指導(dǎo)抗菌藥物的臨床應(yīng)用［8－9］。黏液型銅綠假單胞菌感染患者在老年感染患者中占有一半的比例，隨著老年感染黏液型銅綠假單胞菌程度的加深，抗菌藥物的選擇性更加重要，對(duì)不同抗菌藥物的使用應(yīng)該持續(xù)在48h 內(nèi)治療，而48～72h及之后抗菌藥物對(duì)細(xì)菌敏感性無(wú)明顯增加，耐藥性反而出現(xiàn)加重。因此，抗菌藥物在48h內(nèi)的治療對(duì)黏液型銅綠假單胞菌具有重要意義。臨床醫(yī)生應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)黏液型銅綠假單胞菌的特點(diǎn)和不同抗菌藥物靈敏性的認(rèn)識(shí)，在用藥和治療時(shí)遵循抗菌藥物合理應(yīng)用的治療標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)，對(duì)于實(shí)驗(yàn)室觀察發(fā)現(xiàn)的黏液型銅綠假單胞菌要注意其時(shí)效性，不能耽誤出具報(bào)告，給臨床醫(yī)生節(jié)省合理的治療和用藥時(shí)間，使細(xì)菌在最佳抗菌藥物的峰濃度下用藥，達(dá)到最佳抑菌效果。

本研究結(jié)果顯示，銅綠假單胞菌的體外顯效抗菌藥物較多，總體抗菌藥物靈敏性較強(qiáng)，細(xì)菌耐藥性較弱。這是由于對(duì)菌株藥敏實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)局限于浮游細(xì)菌層面，把細(xì)菌黏膜因素排除在外，忽略了黏膜因素（生物膜）對(duì)抗菌藥物的抵抗作用，不能準(zhǔn)確反應(yīng)抗菌藥物的耐藥性。由此可見(jiàn)，普通銅綠假單胞菌感染采用頭孢類(lèi)、青霉素類(lèi)、喹諾酮類(lèi)等抗菌藥物均能產(chǎn)生較好的殺菌效果。但是，對(duì)于老年黏液型銅綠假單胞菌的抗感染治療，必須排除生物膜的影響才能產(chǎn)生較好的抗感染作用。臨床經(jīng)驗(yàn)證實(shí)，大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗菌藥物羅紅霉素、阿奇霉素等以及第三代喹諾酮類(lèi)抗菌藥氟羅沙星對(duì)細(xì)菌生物膜的生長(zhǎng)抑制作用比較明顯，主要通過(guò)抵抗細(xì)菌多糖蛋白附合物的合成和抑制細(xì)菌生物膜DNA 旋轉(zhuǎn)酶的活性產(chǎn)生抑菌效果。

綜上所述，老年黏液型銅綠假單胞菌的細(xì)菌耐藥性和抗菌藥物靈敏性受菌株表面生物膜的影響，檢測(cè)報(bào)告應(yīng)該控制在48h之后，這對(duì)細(xì)菌菌群檢測(cè)和抗菌藥物耐藥性的判定比較合理。

［1］馬列停，楊多，王亞文，等.酶聯(lián)免疫反轉(zhuǎn)錄檢測(cè)生產(chǎn)ESBL大腸埃希菌感染及抗菌藥物靈敏性和耐藥性研究［J］.中華臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2010，25（11）：110－111.

［2］繆競(jìng)智，張秀珍，李煥婁，等.肺心病患者綠膿桿菌分型耐藥質(zhì)粒DNA 分子雜交的臨床意義［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，1995，12（6）：357－359.

［3］王輝，陳敏俊，劉玲慧.1994～2010年中國(guó)重癥監(jiān)護(hù)病房非發(fā)酵糖型細(xì)菌耐藥性和抗菌藥物靈敏性變遷問(wèn)題的研究分析［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2011，182（15）：1384－1390.

［4］湖北，王靜，嚴(yán)群，等.噬菌體治療實(shí)驗(yàn)性小鼠耐亞胺培南銅綠假單胞菌抗感染方面的耐藥性和耐酶靈敏性研究分析［J］.中華微生物學(xué)和醫(yī)學(xué)免疫學(xué)雜志，2011，26（5）：1438－1441.

［5］馬聰，周厚祥，李海玲，等.黏液型和非黏液型銅綠假單胞菌耐藥性及泛耐藥性臨床分析和診斷研究［J］.中國(guó)感染控制學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2010，18（24）：274－276.

［6］潘博文，付文卓，王曉楠，等.用于大容量人員天然噬菌體抗體庫(kù)的表達(dá)載體的都建和鑒定研究分析［J］.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)面醫(yī)學(xué)雜志，2010，33（15）：1647－1652.

［7］孫靜，余理智，鄧林強(qiáng)，等.黏液型銅綠假單胞菌藥敏試驗(yàn)不同階段結(jié)果分析與研究［J］.江西醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)學(xué)報(bào)，2011，21（6）：1440－1441.

［8］Miyashita N，Kubota Y，Nakajima M，et al.Chlamydia pneumoniae angexacerbations of asthma in adults［J］.Ann Allergy Asthma Immunol，2010，80（12）：1405－1409.

［9］Schmidt SM，Muller C.Bronchial chlamdia pneumoniae infection markers of allergic inflammation and lung function in children［J］.Pediatr Allergy Immunol，2010，12（5）：1257－1265.