柯苑，趙靜，馬成平，黃敏，姚慧蘭，張立波，馬貴明（南京紅十字血液中心實驗室，南京 210003）

血液篩查是確保血液及血液制品安全的重要措施之一，根據(jù)國內(nèi)現(xiàn)行法律法規(guī)的要求，目前使用的酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測的是抗原抗體，但由于感染“窗口期”較長及病毒變異，隱匿性感染等因素的存在，使得臨床輸血存在一定的風(fēng)險。核酸檢測（NAT）技術(shù)可直接檢測病毒核酸，縮短檢測方法的“窗口期”，降低輸血感染的風(fēng)險，已成為發(fā)達國家血液篩查病毒的重要手段［1］。目前可用于血液篩查的NAT 技術(shù)主要有多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）和轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴增技術(shù)（TMA）。本中心于2013年3月正式采用TMA 法核酸檢測工作，建立并完善了血液核酸檢測相關(guān)體系文件，形成了系統(tǒng)的檢測流程。2013年3～10月共檢測了54358份獻血者血液標(biāo)本，檢測效果較好?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本2013年3～10月本中心檢測的54358份獻血者血標(biāo)本。

1.2 儀器與試劑諾華公司Procleix TIGRIS System 檢測系統(tǒng)以及Ultrio HIV－1／HCV／HBV 檢測試劑和鑒別試劑，批號為614952。

1.3 方法采集靜脈血5mL于分離膠抗凝試管中，采集后6 h內(nèi)3000r／min離心15min，放入2～8℃冰箱內(nèi)儲存，48h內(nèi)送實驗室完成標(biāo)本抽提、擴增和檢測工作。測試包括3個主要步驟：（1）通過特異性目標(biāo)捕獲將病毒核酸從標(biāo)本中分離；（2）通過TMA 方法實現(xiàn)目標(biāo)核酸片斷的擴增；（3）雜交保護方法檢測擴增產(chǎn)物。Procleix TIGRIS System 檢測系統(tǒng)聯(lián)檢試劑檢測到陽性標(biāo)本后，可通過人類免疫缺陷病毒1型（HIV－1）鑒別試劑、丙型肝炎病毒（HCV）鑒別試劑、乙型肝炎病毒（HBV）鑒別試劑進行鑒別檢測，以分辨引起反應(yīng)的病毒。鑒別試驗步驟與聯(lián)檢相同，聯(lián)檢陽性標(biāo)本放于－20℃冰箱，1周進行1次鑒別試驗。

2 結(jié)果

2.1 所有標(biāo)本檢測結(jié)果54358份標(biāo)本HBV／HCV／HIV－1聯(lián)檢初篩結(jié)果顯示226份陽性，NAT 陽性ELISA 陰性標(biāo)本共51份。聯(lián)檢初篩陽性標(biāo)本再進行鑒別試驗，結(jié)果顯示HBVDNA、HIV－1RNA、HCV－DNA陽性例數(shù)分別為32例（0.059%）、1例（0.002%）、0例。NAT 陽性ELISA 陰性標(biāo)本共51份，諾華鑒別試劑鑒別率為50%～60%，因此有鑒別結(jié)果的標(biāo)本只有33份。

2.2 HIV－1RNA陽性患者檢測過程顯示為HIV－1RNA陽性的1份標(biāo)本，獻血者于2013年5月12日獻全血400mL，5月13日實驗室ELISA 方法檢測此標(biāo)本HIV 抗體／抗原＋抗體結(jié)果均為陰性，核酸檢測HIV－1RNA 結(jié)果為陽性。5月20日重新抽取該名獻血者全血標(biāo)本，核酸檢查仍為陽性，ELISA為弱陽性。該份獻血者標(biāo)本經(jīng)南京市疾控中心HIV 確證實驗室免疫印跡法（WB）確認為HIV－1疑似陽性。11月27日，再次抽取該名獻血者血標(biāo)本送市疾控中心經(jīng)WB法確認為HIV－1陽性。見表1。

表1 HIV－1RNA 陽性ELISA 陰性標(biāo)本初篩及隨訪結(jié)果

3 討論

常規(guī)酶聯(lián)免疫檢測法可檢測血液中的抗原和抗體，但當(dāng)獻血者在感染“窗口期”或隱匿性感染時獻血，受血者將面臨輸血后感染HIV 或肝炎病毒的風(fēng)險。有文獻表明，美國90%以上輸血傳播HIV 和HBV 感染以及75%以上輸血傳播HCV 感染均來自“窗口期”患者血液［2－3］。我國屬于肝炎的高發(fā)區(qū)，人群中HBsAg攜帶率為9.09%，HBV 流行率大于60%［4］。我國目前篩查獻血者是否感染HBV 的指標(biāo)仍為HBsAg，因此不能消除HBV 感染“窗口期”以及隱匿性感染造成的漏檢。本研究54358份獻血者標(biāo)本中檢出32例ELISA 陰性HBVDNA 陽性標(biāo)本，陽性率比深圳地區(qū)報道的131174份血清學(xué)陰性標(biāo)本檢出22份HBV－DNA 陽性標(biāo)本結(jié)果略高［5］。沒有檢出HCV 陽性而ELISA 陰性的獻血者，與國內(nèi)青島、江西等地區(qū)相關(guān)報道相似［6－7］。ELISA檢測陰性，但實際HIV－1RNA為陽性的獻血者檢出1例，通過回訪了解到該例患者是1例典型的處于HIV 感染“窗口期”的案例，目前使用的HIV酶免檢測試劑為第3代和第4代組合，第4代試劑的“窗口期”比第三代雖然縮短了1周左右但還是大于NAT 的“窗口期”。如果只用ELISA 法將會造成漏檢，該獻血者所獻的400mL全血將按常規(guī)制備成懸浮紅細胞，血漿和冷沉淀等3種血液制品用于臨床，有可能輸給3名患者造成輸血后HIV 病毒感染。根據(jù)國內(nèi)疾病預(yù)防控制中心報道，2013年1月新增HIV 感染者／AIDS患者7365例，其中輸血及使用血制品傳播37例［8］。

與ELISA 法相比，NAT 法具有更高的敏感度和特異性，通過縮短“窗口期”可以對感染做到早期檢測，進一步減少輸血造成疾病傳播的可能性。NAT 檢測幾乎不受ELISA 檢測制約因素的影響，故兩種檢測技術(shù)存在良好的互補性。將NAT作為采血血樣的常規(guī)篩查技術(shù)，可為臨床安全用血提供有力保障。與其他NAT 檢測方法相比，目前使用的TMA 法優(yōu)點主要有：（1）可以在1支試管內(nèi)同時檢測多個病毒，檢測前不需要混樣，簡化了檢測過程；（2）減少血液篩查步驟和縮短處理時間，省去了陽性標(biāo)本進一步拆分的過程，從而更快得到結(jié)果。但是NAT 也不能完全取代ELISA 檢測，首先NAT 篩查血液所需試劑成本昂貴，對檢測環(huán)境、基礎(chǔ)設(shè)施等要求較高。其次NAT 篩查血液并不能完全杜絕輸血傳染病的風(fēng)險，其檢測效果取決于檢測系統(tǒng)的有效運轉(zhuǎn)和檢測靈敏度。研究表明，低病毒載量的感染標(biāo)本容易在NAT 篩查時被漏檢，因此對NAT試劑的靈敏度提出了更高的要求。NAT 操作步驟較復(fù)雜，在人員培訓(xùn)、管理模式上都與酶免檢測存在較大區(qū)別，對操作人員的技能要求較高，需要嚴格的防污染措施以避免標(biāo)本間交叉污染和擴增產(chǎn)物污染，同時需對整個檢測流程進行質(zhì)量控制。

綜上所述，獻血相關(guān)法律法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)尚未涉及血液篩查假陽性獻血者獻血資格的保留問題，因此上級管理部門也應(yīng)該在NAT 全面應(yīng)用于血液篩查之前，以保障血液安全為大前提，對單獨NAT 陽性獻血者告知以及獻血資格是否保留等問題做出明確規(guī)定，作為廣大采供血機構(gòu)執(zhí)行的依據(jù)。

［1］Engelfriet CP，Reesink HW.Implementation of donor screening for infectious agents transmitted by blood by nucleic acid technology（International Forum）［J］.Vox Sanguinis，2002，82（1）：87－111.

［2］文國新，美黑麗.血液感染性安全問題的現(xiàn)狀與展望［J］.中國輸血雜志，2006，19（4）：332－334.

［3］曾勁峰，楊寶成.血液篩查核酸檢測的建立及應(yīng)用［J］.中國輸血雜志，2008，21（11）：827－828.

［4］梁曉峰，陳園生，王曉軍.中國3歲以上人群乙型肝炎血清流行病學(xué)研究［J］.中華流行病學(xué)雜志，2005，26（9）：655－658.

［5］葉賢林，李活，許曉絢，等.核酸擴增技術(shù)在獻血者血液HBV－DNA、HCV－RNA 及HIV－1RNA 篩查中的應(yīng)用研究［J］.中國輸血雜志，2010，23（1）：6－10.

［6］吳玉清，楊忠思，趙林，等.青島地區(qū)無償獻血者血液病毒核酸檢測的研究［J］.中國輸血雜志，2008，21（11）：834－836.

［7］苗燕平，何華慶，后平欽，等.NAT 檢測在血液篩查中的應(yīng)用［J］.實驗與檢驗醫(yī)學(xué)，2010，28（3）：325－326.

［8］中國疾病預(yù)防控制中心，性病艾滋病預(yù)防控制中心.2013年1月全國艾滋病性病疫情及主要防治工作進展［J］.中國艾滋病性病，2013，19（3）：159－160.