劉愛軍 陳杏曄 廣州中醫(yī)藥大學組胚教研室（廣州510006）

△廣州中醫(yī)藥大學2012級研究生（廣州510006）

皮膚覆蓋在人體表面，在日常生活中極易受到損傷，毛囊真皮的成纖維細胞（fibroblast）能分泌Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、FN（fibronectin）等ECM成分和堿性成纖維細胞生長因子（base fibroblast growth factor，bFGF）、血管內(nèi)皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等多種細胞因子，能促進各種生長因子的分泌，誘導皮膚表皮細胞的增殖和遷移，促進皮膚創(chuàng)面的完整修復。七厘散是著名的傷科常用中成藥，本項目組前期研究證明七厘散能促進創(chuàng)面成纖維細胞分泌膠原纖維，促進新生毛細新生，修復表皮和毛囊，但中藥促進皮膚愈合的作用機理并不清楚。本文通過探討七厘散含藥血清對分離培養(yǎng)的SD乳鼠觸須部毛囊真皮根鞘細胞增殖的影響，為更加深入的研究中藥促進細胞增殖和分化的分子機制；尋找切實、有效的藥物作用靶點奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 出生3d的SD乳鼠（雌雄不拘），用于取觸須部毛囊。雄性SD大鼠（質(zhì)量180－200g），用于制備含藥血清。以上實驗動物均由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑與儀器 HG－DMEM培養(yǎng)（美國Gibco公司）；優(yōu)質(zhì)胎牛血清（FBS）（天津灝洋生物制品科技有限責任公司）；青霉素/鏈霉素（Hyclone公司）；0.01mmol/L PBS（Hyclone公司）；0.25%胰蛋白酶（美國Sigma公司）；倒置相差顯微鏡（日本Olympus）；RT－2100C酶標儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司）；Ⅰ抗：層黏連蛋白（Laminin，LN）、纖黏連蛋白（Fibronectin，F(xiàn)N）、波形蛋白（Vimentin）（均購自武漢博士德試劑公司）；Ⅱ抗IgG、SABC－Cy3試劑盒（武漢博士德試劑公司）；核熒光標記物DAPI（美國Sigma公司）。中成藥七厘散（批號：0100033，北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠）

1.3 方法

1.3.1 SD乳鼠毛囊真皮細胞的獲取 將出生3d的同一胎次的、正常發(fā)育的SD乳鼠10只浸泡于75%酒精中，5min×3次。剪去帶有完整觸須部毛囊的皮膚，雙抗D－Hank’s液洗1次，無雙抗D－Hank’s液洗2次。超凈工作臺內(nèi)分離出完整的觸須毛囊，均勻置于T25培養(yǎng)瓶，添加少量10%FBS的HGDMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，24h后添加培養(yǎng)基，細胞長滿后按1∶3進行傳代。

1.3.2 細胞爬片的制作 將P2代細胞消化稀釋成細胞懸液，按1×107/L接種于放有消毒蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，每孔接種1mL，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，待細胞長滿蓋玻片50%左右時，取出蓋玻片，0.01mmol/L PBS洗3次，中性甲醛固定30min，0.01mmol/L PBS洗3次。

1.3.3 免疫熒光顯微鏡檢測 P3代毛囊真皮細胞爬片，免疫熒光檢測LN、FN、Vimentin的表達（實驗步驟按產(chǎn)品說明書進行），Ⅰ抗效價均為1∶100，Ⅱ抗效價1∶100，SABC－Cy3顯色后，DAPI復染細胞核，熒光顯微鏡觀察拍照。

1.3.4 七厘散含藥血清的制備 七厘散灌胃液按0.15g/1.5mL配制，每天每只大鼠灌胃兩次，間隔12h，灌胃量1.5mL/200g，連續(xù)灌胃，分別在3d、5d、7d腹主動脈血，每個時間點共灌胃5只大鼠，取血當日早晨再灌胃1次，間隔1h，麻醉大鼠，打開腹腔，負壓管抽腹主動脈血。靜置30min，3000r/min離心10min，吸取上層血清，將所得同一時間點的5只大鼠的血清混合，50℃滅活30min，0.2μm 濾膜過濾除菌，分裝，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 MTT檢測 七厘散含藥血清對P3代毛囊真皮細胞增殖的影響 將P2代毛囊細胞制成細胞懸液，按3000個/孔種植入96孔板，24h后更換無血清DMEM培養(yǎng)基；24h后棄培養(yǎng)基，將細胞分成空白對照組、無血清組、0%含藥血清組、2.5%含藥血清組、5%含藥血清組、10%含藥血清組、20%含藥血清組，F(xiàn)BS補足血清總體積百分比為20%，每組7個復孔，分別添加相應(yīng)的藥物100μL/孔；24h后棄培養(yǎng)基，加入0.5mg/mL MTT 100μL/孔；37℃、5%CO2條 件 下 放 置 4h，加 DMSO100μL/孔，震蕩10min，紫外分光光度計檢測。

1.4 統(tǒng)計學處理 定量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件中單因素方差分析（one－way ANOVA）進行組間均數(shù)的比較，兩兩組間均數(shù)比較視方差齊性檢驗（以0.1作為檢驗水準進行Levene檢驗）結(jié)果，當方差齊同時，用LSD檢驗，當方差不齊時，用Tamhane’s T2檢驗。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 SD乳鼠毛囊細胞分離培養(yǎng)結(jié)果 種植后細胞很快貼壁，24h后可見貼壁細胞呈，可見從SD乳鼠毛囊有成纖維狀細胞遷出（圖1），3d細胞長滿培養(yǎng)瓶約80%左右，進行傳代，殘留的毛囊及組織塊隨著傳代和換液逐漸除去，細胞傳至P3代時呈較純化的成纖維狀細胞（圖2）。

2.2 SD乳鼠毛囊真皮細胞免疫熒光檢測結(jié)果

分離培養(yǎng)的SD乳鼠毛囊真皮成纖維狀細胞，免疫熒光檢測FN（圖3）、LN（圖4）、Vimentin（圖5）表達陽性。

2.3 MTT檢測七厘散含藥血清對P3代毛囊真皮細胞增殖的影響 七厘散灌胃后，3d、5d、7d含藥血清對P3代毛囊真皮細胞24h增殖的作用趨勢相同，均在含藥血清5%組對細胞促增殖作用達到最大，并且促增殖作用優(yōu)于普通的胎牛血清；之后隨著含藥血清體積百分比增加促增殖作用下降。3d和5d含藥血清組的促增殖作用優(yōu)于7d含藥血清組。

表1 七厘散含藥血清作用24h對SD乳鼠毛囊成纖維細胞增殖的影響

取3d、5d、7d含藥血清組的數(shù)值分別進行單因素ANOVA分析，3d組F＝0.014，采用LSD法，發(fā)現(xiàn)不同體積分數(shù)含藥血清組間有顯著性差異（P＝0.03），3d含藥血清組中5%含藥血清組刺激細胞增殖效果最佳；5d組、7d組方差不齊（分別為F＝0242，F(xiàn)＝0.219），用Tamhane’s T2檢驗方法，空白組與其他組之間有顯著性差異（P＜0.004），其它組間差異均無顯著性意義（P＞0.05），可見3d組5%七厘散含藥血清對細胞促增殖作用最好。

3 討 論FSC是組織工程皮膚理想的種子細胞，但是毛囊干細胞的有效增殖和定向分化至今仍未解決［1－4］。毛囊真皮根鞘中的成纖維細胞能分泌Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、FN等ECM 成分和bFGF、VEGF、EGF等多種細胞因子［5，6］，能促進FSC分化為表皮細胞并促進毛囊的完整修復，因此深入研究毛囊真皮鞘成纖維細胞的生物學特性、利用其改善毛囊干細胞的增殖和定向分化能力具有重要意義。

七厘散是著名的傷科常用中成藥，廣泛應(yīng)用于外科瘡瘍、燙傷、跌打損傷、金刃重傷等病癥，療效顯著。本項目組前期研究證明七厘散作用于小鼠觸須部去表皮創(chuàng)面，具有明顯的抗炎、促修復作用。創(chuàng)面修復早期有大量炎細胞滲出、浸潤；修復中期表皮細胞、成纖維細胞增殖明顯，膠原纖維的合成和分泌增加；修復晚期真皮膠原纖維排列規(guī)則，新生毛細血管較多，創(chuàng)面表皮修復，毛囊重新形成，其療效優(yōu)于臨床西藥EGF，說明中藥通過對創(chuàng)面微環(huán)境的改善，促進膠原纖維的合成和分泌，膠原纖維能有效促進表皮細胞的遷移和分化［7］，能促進表皮及毛囊的重新生成［8］。

本實驗免疫熒光檢測所分離培養(yǎng)的毛囊真皮細胞FN、LN、Vimentin表達陽性，說明所培養(yǎng)的細胞是成纖維細胞。七厘散灌胃后3d、5d、7d的含藥血清按不同體積百分比作用于體外培養(yǎng)的毛囊真皮成纖維細胞24h，7d七厘散含藥血清組較3d組和5d組促增殖作用較差。七厘散含藥血清體積百分數(shù)5%促增殖效果最佳，SPSS統(tǒng)計軟件分析發(fā)現(xiàn)，3d組和5d組優(yōu)于7d組，且3d組和5d組之間差別無統(tǒng)計學意義，說明灌胃3d即為最佳的時間點。每組中均隨著七厘散含藥血清體積百分比增加，促毛囊真皮成纖維細胞增殖的作用增強，當七厘散含藥血清體積百分數(shù)5%促增殖效果最佳，之后隨著含藥血清體積百分比增加，促增殖作用下降，說明七厘散對真皮成纖維細胞生長的調(diào)節(jié)是雙向的，在創(chuàng)傷修復中以促增殖為主，當修復到一定程度，促增殖作用下降，防止膠原纖維過度堆積，形成瘢痕組織，充分體現(xiàn)了中藥促進皮膚愈合的整體性和雙向性調(diào)節(jié)［9，10］。

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