考玉萍 付立明 劉滿軍 袁秋貞 陜西省中醫(yī)醫(yī)院（西安710003）

怡心顆粒為中藥復(fù)方制劑，系由柴胡、白芍、當(dāng)歸、遠(yuǎn)志、石菖蒲、五味子、炒酸棗仁、丹參、夜交藤、茯苓、生龍骨、生牡蠣、磁石、甘草組成。它是在古方逍遙丸［1］的基礎(chǔ)上加入炒酸棗仁、生龍骨、磁石等中藥組成，主要用于治療肝郁脾虛所致的郁悶不舒，食欲減退、失眠等病癥，經(jīng)臨床使用療效肯定。為有效控制該制劑的質(zhì)量，本文采用多波長－高效液相色譜法建立了同時測定怡心顆粒中丹參素及甘草酸二種成分的含量測定方法，結(jié)果表明，本法簡便，專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，為控制怡心顆粒質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料1.1 儀 器 Waters2695高效液相色譜儀（美國沃特斯），2996紫外檢測器（美國沃特斯）；Empower色譜工作站，GB204電子天平（瑞士梅特勒托利多，精密度0.01mg）；超聲清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司，型號SB－3200D，180W，40KHz）。

1.2 材 料 怡心顆粒（院內(nèi)制劑，批號：20110801、20111002、20111011）；丹參素鈉對照品（中國藥品生物制品鑒定所，批號：110855－200506）；甘草酸銨對照品（中國藥物生物制品鑒定所，批號：110731－200513）。乙腈（色譜純，美國Fisher公司），其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取丹參素鈉、甘草酸銨對照品各1.70mg、2.25mg，置于10mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備 取怡心顆粒10mL，用水飽和正丁醇萃取3次，每次30mL，合并正丁醇萃取液，蒸干，殘渣用甲醇溶解并定容至10mL量瓶，搖勻，即得供試品溶液。

2.3 色譜條件 色譜柱：Accurasil C18（5μm，4.6mm×250mm）；流動相：乙腈（A）－0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫程序為0～15min（5%～11.5%A），15～20min（11.5%～13%A），20～25min（13%～5%A），25～30min（15%～20%A），30～50min（20%～25%A），50～60min（25%～40%A），60～70min（40%～45%A），70～75min（45%～55%A）；流速1.0mL·min－1；檢測波長：丹參素鈉286nm，甘草酸銨252nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10μL。在上述色譜條件下丹參素鈉、甘草酸銨對照品溶液和怡心顆粒供試品溶液高效液相色譜圖，見圖1。

圖1 怡心顆粒高效液相色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對照品溶液2.5、5、7.5、10、15、20μL按“2.3”項下色譜條件進(jìn)樣，測定峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。丹參素鈉和甘草酸銨回歸方程分別為 Y＝5.7401×104X－9409.8，r＝0.9987；Y＝7.9735×104X＋15371，r＝0.9989。結(jié)果表明：丹參素鈉和甘草酸銨分別在0.212～1.701μg·mL－1、0.0563～0.451μg·mL－1與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液10 μL，按照“2.3”項下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，計算得丹參素鈉和甘草酸銨峰面積的RSD分別為1.56%、2.22%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗 取同一批號樣品（批號：20110801）6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進(jìn)樣，測定峰面積，計算得丹參素鈉和甘草酸銨峰面積的RSD分別為2.21%、0.95%，表明方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一樣品（批號：20110801）溶液，室溫放置，按“2.3”項下色譜條件，于0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣，測定峰面積，計算得丹參素鈉和甘草酸銨峰面積的RSD分別為2.84%、2.72%。表明供試品溶液在室溫放置24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 回收率試驗 精密量取已知含量的樣品（批號：20110801）5.0mL，置10mL量瓶中，分別精密加入丹參素鈉0.470mg，甘草酸銨0.143mg，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。按照“2.3”項下色譜條件進(jìn)樣，測定峰面積，計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗

2.9 樣品測定 精密量取3份不同批次的樣品適量，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，參照“2.3”項下色譜條件依次進(jìn)樣分析，測定峰面積，計算丹參素鈉和甘草酸銨的含量，再由丹參素鈉和甘草酸銨對照品折算得到丹參素和甘草酸的含量，結(jié)果見表2。

表2 丹參素、甘草酸含量測定結(jié)果

3 討論與結(jié)論3.1 測定指標(biāo)的選擇 怡心顆粒為逍遙丸加入炒酸棗仁、磁石等中藥，經(jīng)提取純化等工藝加工而成的中藥復(fù)方制劑，為我院多年臨床經(jīng)驗方，具有抗抑郁、抗焦慮、改善睡眠等療效。2010版《中國藥典》中，逍遙丸及逍遙顆粒的含量檢測指標(biāo)均為芍藥苷［2］，但作為中藥復(fù)方制劑，單一成分并不能很好控制其質(zhì)量，因此，本文采用HPLC法同時測定丹參素［3］及甘草酸的含量，以控制該制劑的質(zhì)量。

由于丹參素和甘草酸對照品不易結(jié)晶，很難得到，而丹參素鈉和甘草酸銨對照品易結(jié)晶，在提取，精制等方面相對容易，可得較高純度。因此，本實驗采用丹參素鈉和甘草酸銨對照品折算丹參素與甘草酸的含量。

3.2 檢測波長選擇 實驗過程中，我們采用紫外檢測器進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果各化學(xué)成分響應(yīng)值分別出現(xiàn)在不同位置。如丹參素鈉在286nm處有最大吸收，而甘草酸銨在252nm處有最大吸收，與參考文獻(xiàn)資料相符合［4，5］，因此，最終選擇了多波長進(jìn)行檢測。

3.3 流動相選擇 該樣品為中藥復(fù)方制劑，化學(xué)成分復(fù)雜，化合物極性差異較大，預(yù)實驗過程中曾嘗試采用甲醇－水、乙腈－水、乙腈－磷酸溶液為流動相，進(jìn)行梯度洗脫［6］。結(jié)果發(fā)現(xiàn)水相中加入少量酸可減少拖尾、提高靈敏度，考慮色譜柱的保護(hù)采用0.1%磷酸水作為水相。故最終確定流動相為乙腈－0.1%磷酸水系統(tǒng)梯度洗脫。結(jié)果顯示，該條件下測定，各色譜峰分離度高、峰形好、理論塔板數(shù)高。

［1］國家藥典委員會.中國藥典.一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：256.

［2］梁曉東，時秀英.HPLC法測定逍遙丸中芍藥苷的含量［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2011，10（10）：27－29.

［4］張 克.HPLC法測定蓋艾康膠囊中甘草酸含量［J］.中醫(yī)研究，2011，24（4）：20－22.

［5］屈 蓉，仇雅靜，陳驍鵬，等.高效液相色譜法測定心可舒片中丹參素鈉和原兒茶醛含量［J］.中國藥業(yè)，2012，21（19）：23－24.

［6］李會娟，張 寧.逍遙散高效液相色譜指紋圖譜的研究［J］.中成藥，2011，33（6）：913－916.