張世強，王保慶，王海清，張旭東

(1徐州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院放療三科，徐州 221006;2徐州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科;3徐州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科;*通訊作者，E-mail:13952234612@163.com)

惡性腫瘤患者的血清中有大量的游離DNA存在，其含量約為健康人的10倍以上，研究［1－3］表明，在腫瘤的生長過程中，腫瘤細(xì)胞不斷釋放DNA進(jìn)入外周血液，這類血清游離DNA的遺傳特性與腫瘤細(xì)胞基因組DNA相同。國外學(xué)者通過檢測肺癌患者血清游離DNA中的特定突變基因，指導(dǎo)臨床個體化靶向治療已經(jīng)取得較好的臨床療效［4－6］，因此，血清游離DNA的檢測在惡性腫瘤的診斷和治療中具有重要的應(yīng)用價值。本研究以非小細(xì)胞肺癌患者為研究對象，通過分析非小細(xì)胞肺癌患者治療前后血清游離DNA水平的變化，以期為血清游離DNA水平在肺癌臨床診治中的推廣應(yīng)用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2013－05～2014－03收治的非小細(xì)胞肺癌患者65例，年齡41－74歲，中位年齡51.9歲;所有患者均有細(xì)胞病理學(xué)證據(jù)確診，其中:I期8例、Ⅱ期24例、Ⅲ期18例、Ⅳ期15例;鱗癌34例、腺癌31例。32例Ⅰ－Ⅱ期的患者均采取手術(shù)治療，33例Ⅲ－Ⅳ期患者采取相同的化療方案治療，同時收集健康志愿者60例作為對照組，年齡39－64歲，中位年齡44歲。所有研究對象均簽署知情同意書，治療前均排除肝炎、糖尿病、慢性炎癥、高血脂及免疫性疾病史。

1.2 外周血樣本采集及血清DNA提取

分別抽取檢測對象前臂靜脈血4 ml(肺癌患者在手術(shù)和化療前后進(jìn)行抽血)。室溫放置2 h后用低溫高速離心機(jī)將靜脈血離心(20℃，3 000 r/min，10 min)，棄下液，取上層液血清1 ml放置入2 ml凍存試管，然后將血清置于－80℃冰箱保存?zhèn)溆?。血清DNA以磁珠法全血基因組DNA抽提試劑盒(美國Omega公司生產(chǎn))抽提，按說明書所述的方法抽提血清DNA。

1.3 血清游離DNA定量

參照文獻(xiàn)［6］應(yīng)用熒光定量PCR進(jìn)行血清游離DNA的定量，設(shè)計表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)引物和熒光定量 PCR檢測EGFR胞質(zhì)區(qū)外顯子28編碼引物序列如下:上游引物:5’－CCTGTCATAAGTCTCCTTGTTGAG－3’，下游引物:5’－CAGTCTGTGGGTCTAAGAGCTAATG－3’，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。取2μl DNA進(jìn)行定量PCR檢測，血清游離DNA含量(單位:拷貝數(shù)/ml血清)按以下公式計算:C=Q×(VDNA/VPCR)×(1/Vext)，公式中 C為 EGFR拷貝數(shù)、Q為CPD(cytoplasmic domain)拷貝數(shù)、VDNA為DNA抽提后的體積(20μl)、VPCR為定量PCR檢測時加入的DNA量(2μl)、Vext為用于抽提 DNA的血清體積(ml)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 肺癌組及健康對照組血漿游離DNA水平比較

實驗結(jié)果表明，65例非小細(xì)胞肺癌組血漿游離DNA 水平為(165.2±41.6)ng/ml，健康對照組血漿游離DNA水平為(13.8±6.3)ng/ml，肺癌組明顯高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01，見表1)。

2.2 血漿游離DNA水平與肺癌臨床病理特征的關(guān)系

肺癌組患者按照腫瘤大小、病理類型及臨床分期進(jìn)一步分組，結(jié)果表明，腫瘤直徑＞3 cm的患者血漿游離DNA水平明顯高于腫瘤直徑＜3 cm的肺癌患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，同時Ⅲ－Ⅳ期的患者血漿游離DNA水平明顯高于Ⅰ－Ⅱ期的肺癌患者，兩者之間差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，而按照病理分型分組比較，鱗癌組與腺癌組的患者血漿DNA水平差異無顯著性(P＞0.05，見表2)，提示肺癌患者血漿游離DNA水平與腫瘤負(fù)荷及臨床分期有密切的關(guān)系，但與肺癌患者的病理分型無明顯相關(guān)性。

表1 肺癌組以及對照組血漿游離DNA水平 (ng/ml)Table 1 Level of plasma DNA in lung cancer group and control group (ng/ml)

表2 血漿游離DNA水平與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系 (ng/ml)Table 2 Relationship between plasma DNA level and clinical pathological features of NSCLC (ng/ml)

2.3 血漿游離DNA水平與肺癌療效的關(guān)系

32例患者采取手術(shù)治療，其術(shù)后血漿游離DNA水平較術(shù)前顯著性下降，與術(shù)前比較差異具有顯著性(P＜0.01，見表3)，可能與患者術(shù)后體內(nèi)腫瘤細(xì)胞負(fù)荷減少有關(guān);另外，33例肺癌患者采取相同的化療方案治療，化療有效的患者，其血漿游離DNA水平在化療后明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，而化療無效的患者，其血漿游離DNA水平在化療后雖有一定程度的下降，但統(tǒng)計分析差異無顯著性(P＜0.01)，進(jìn)一步對兩組患者化療后比較發(fā)現(xiàn)，化療有效的肺癌患者血漿游離DNA水平顯著低于化療無效的患者(P＜0.01)，提示血漿游離DNA水平治療前后的變化可作為肺癌患者臨床療效的判斷指標(biāo)。

3 討論

血清游離DNA是一種存在于體液中的游離狀態(tài)的脫氧核糖核酸，正常人的外周血游離DNA來源于淋巴細(xì)胞或其他有核細(xì)胞，腫瘤患者的外周血游離DNA主要來源于腫瘤細(xì)胞的壞死或凋亡、循環(huán)腫瘤細(xì)胞裂解所釋放，血清游離DNA與惡性腫瘤組織DNA具有相同的遺傳變異特性［7］。眾多研究表明［8－11］，血清游離DNA含量的檢測具有廣泛的臨床應(yīng)用價值，血清游離DNA檢測有助于早期發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的高危人群。此外，血清游離DNA具有可動態(tài)觀測的優(yōu)勢，因而在惡性腫瘤的治療過程中檢測血清游離DNA的變化趨勢，有助于在判斷臨床療效及指導(dǎo)治療方案的及時調(diào)整。

在本研究中發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌患者血清中DNA濃度比健康對照者明顯升高(P＜0.01)，提示檢測血漿游離DNA水平可作為肺癌早期篩選的重要指標(biāo)之一，國外有關(guān)血清游離DNA與腫瘤的研究中也有類似的結(jié)論［12］。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，血清游離DNA和肺癌患者的腫瘤大小、臨床分期有密切的關(guān)系，腫瘤直徑＞3 cm或分期較晚的患者血漿游離DNA水平明顯升高，統(tǒng)計學(xué)差異具有顯著性(P＜0.01)，尤其對于肺癌術(shù)后及化療有效的患者而言，血清游離DNA的水平明顯下降(P＜0.01)，提示血清游離DNA的水平可間接反映肺癌患者體內(nèi)的腫瘤負(fù)荷，同時可作為療效評估的重要指標(biāo)，國內(nèi)學(xué)者溫開鎮(zhèn)等亦有類似的報道［13］。對肺癌患者不同病理類型血清游離DNA水平進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，腺癌患者和鱗癌患者之間血清游離DNA水平無明顯差異，該結(jié)果與國內(nèi)學(xué)者鄧水秋的研究結(jié)果不一致［14］，其研究認(rèn)為肺癌患者中腺癌患者血清游離DNA水平明顯高于鱗癌患者，不一致的原因可能與本研究樣本例數(shù)較小或未能采取隨機(jī)的原則選擇病例有關(guān)，故仍需進(jìn)一步深入的探討。

總之，血清游離DNA定量分析取材方便，對患者造成的痛苦較小，而且易于被患者接受，檢測血清中游離DNA水平可間接反映肺癌患者體內(nèi)的腫瘤負(fù)荷，而且在肺癌早期診斷及臨床療效的評價中具有一定的應(yīng)用價值，值得進(jìn)一步推廣應(yīng)用。

表3 血漿游離DNA水平在肺癌治療前后的變化(ng/ml)Table 3 Changes of plasma DNA Level before and after treatment in patients with lung cancer (ng/ml)

［1］Diaz LA Jr，Bardelli A.Liquid Biopsies:Genotyping circulating tumor DNA ［J］.J Clin Oncol，2014，32(6):579－586.

［2］Widschwendter M，Menon U.Circulating methylated DNA:A new generation of tumor markers［J］.Clin Cancer Res，2006，12(24):7205－7208.

［3］Sonobe M，Tanaka F，Wada H.Lung cancer-related genes in the blood［J］.Ann Thorac Cardiovasc Surg，2004，10(4):213－217.

［4］Nakamura T，Sueoka-Aragane N，Iwanaga K，etal.A noninvasive system for monitoring resistance to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors with plasma DNA［J］.J Thorac Oncol，2011，6(10):1639 – 1648.

［5］Liu XQ，Lu YC，Zhu GS，etal.The diagnostic accuracy of pleural effusion and plasma samples versus tumour tissue for detection of EGFR mutation in patients with advanced non-small cell lung cancer:comparison of methodologies［J］.J Clin Pathol，2013，66:12 1065－1069.

［6］楊順芳，董強剛，張佩玲，等.肺癌患者血清中游離DNA含量與腫瘤標(biāo)志物相關(guān)性分析［J］.標(biāo)記免疫分析與臨床，2006，13(1):7－10.

［7］Jahr S，Hentze H，Englsch S，etal.DNA fragments in the blood plasma of cancer patients:quantitations and evidence for their origin from apoptotic and necrotic cells［J］.Cancer Res，2001，61(4):1659－1665.

［8］García-Olmo DC，Domínguez C，García-Arranz M，etal.Cell-free nucleic acids circulating in the plasma of colorectal cancer patients induce the oncogenic transformation of susceptible cultured cells［J］.Cancer Res，2010，70(2):560－567.

［9］Szpechcinski A，Dancewicz M，Kopinski P，etal.Real-time PCR quantification of plasma DNA in non－small cell lung cancer patients and healthy controls［J］.Eur J Med Res，2009，14(Suppl 4):237－240.

［10］王宏，潘世揚，徐建，等.子宮頸疾病患者血漿循環(huán)含量的研究［J］.中華婦產(chǎn)科雜志，2011，46(7):501－504.

［11］黃朝暉，胡瑜，華東，等.定量PCR檢測肝細(xì)胞患者血漿循環(huán)DNA 及其臨床意義［J］.中國癌癥雜志，2010，20(9):663－667.

［12］Sirera R，Bremnes RM，Cabrem A，etal.Circulating DNA is a useful prognostic factor in patients with advanced non-small cell lung cancer［J］.JThorac Oncol，2011，6(2):286－290.

［13］溫開鎮(zhèn)，張忠英.熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測肺癌患者血漿循環(huán)DNA及其臨床意義［J］.中華呼吸與結(jié)核病雜志，2008，31(12):933－934.

［14］鄧水秋，歐陽學(xué)農(nóng)，余宗陽，等.晚期非小細(xì)胞肺癌血清游離DNA 水平變化及意義［J］.山東醫(yī)藥，2013，53(30):6－8.