孟 賀，孫 萌，張文茹，徐 強，李湛潔

(1河北聯(lián)合大學口腔醫(yī)學院修復教研室，唐山 063000;2河北聯(lián)合大學附屬醫(yī)院超聲科;3唐山市協(xié)和醫(yī)院口腔科;4唐山市婦幼保健醫(yī)院口腔科;*通訊作者，E-mail:menghe10.2@163.com)

鎳鉻合金由于其機械性能優(yōu)良、制作簡單、價格低廉，在口腔修復領域得到了很廣泛的應用。近年來，人們越來越關(guān)注鎳鉻合金應用后的生物安全性問題及鎳鉻合金在口腔復雜環(huán)境下的離子釋放行為。關(guān)于其可能引起的細胞損傷、局部組織和全身毒性反應等問題已有較多的研究，而關(guān)于鎳鉻合金對凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2表達的影響報道較少。本文選用臨床上牙科修復常用鎳鉻合金材料作為研究對象，檢測鎳鉻合金金屬離子對小鼠成纖維細胞L929凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2表達的影響，探討鎳鉻合金金屬離子與細胞凋亡的關(guān)系。

1 實驗材料和方法

1.1 細胞系

小鼠成纖維細胞L929，由天津塞爾生物技術(shù)有限公司細胞所提供。

1.2 試件的制作及浸提液的制備

精密鑄造規(guī)格為15 mm×15 mm×2 mm的鎳鉻合金(Stellite，上海)試件8個，打磨拋光后，超聲清洗15 min。去離子水沖洗數(shù)遍后置于玻璃小瓶中，將金屬片于121℃高壓滅菌后置于6孔板中。以含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液為浸提介質(zhì)，按照試件表面積與浸提液體積比值為1.25×1 000 cm2/L的標準［1］，將浸提介質(zhì)加入6孔板中，在37℃、5%CO2條件下連續(xù)浸提7 d，制備浸提液待用。

1.3 試劑和儀器

RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco，美國)，胎牛血清(TBD，天津)，細胞培養(yǎng)箱(HERA Cell 150，Heraeu，德國)，倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)，胰蛋白酶(GIBCO，美國)，兔抗鼠Bcl-2多克隆抗體(博奧森，北京)，兔抗鼠Bax多克隆抗體(博奧森，北京)、辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG(博奧森，北京)、免疫組化試劑盒(PV6001，天津)。

1.4 L929細胞的生長代謝曲線

用0.25%胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的L929細胞，分別以(1－10)×107個/L的細胞濃度接種于96孔板，每個濃度接種8個孔，然后將培養(yǎng)板置于孵箱中，在37℃、5%CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱中，孵育72 h。加入5 g/L MTT溶液(每孔20μl)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，倒掉原液，PBS清洗后加入二甲亞砜(每孔150μl)室溫下振蕩20 min。在490 nm波長下用酶聯(lián)檢測儀檢測吸光度(A值)。實驗重復3次。

1.5 MTT實驗檢測鎳鉻合金細胞毒性

根據(jù)細胞生長代謝曲線確定L929細胞濃度，接種于96孔板，培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后，倒掉原培養(yǎng)液并將其分為鎳鉻合金組與陰性對照組，分別加入鎳鉻合金浸提液及含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，每組8個孔。培養(yǎng)48 h后，用酶聯(lián)檢測儀在波長490 nm條件下測各組吸光度(A)值，計算細胞相對增殖率(relative growth rate，RGR)，公式:RGR=(鎳鉻合金組A值/陰性對照組A值)×100%。根據(jù)毒性分級法評分:0級，細胞增殖率為≥100%;1級，75%－99%;2 級，50%－74%;3 級，25%－49%;4級，1%－24%;5級，0%。

1.6 免疫組化反應檢測Bax、Bcl-2蛋白表達

實驗分為鎳鉻合金組Bax、陰性對照組Bax、鎳鉻合金組Bcl-2及陰性對照組Bcl-2，將對數(shù)生長期的小鼠成纖維細胞L929以6×107個/L的濃度接種于放有蓋玻片的6孔板中，加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。待細胞貼壁后棄去原培養(yǎng)基，分別加入鎳鉻合金浸提液及含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，每組設立兩個復孔，培養(yǎng)48 h。按照試劑盒說明書進行操作，鏡下觀察并拍攝照片。每張切片隨機選取3個視野，Bax及Bcl-2在細胞質(zhì)中呈棕黃色染色為陽性表達，以細胞未著色為陰性。在高倍鏡(×400)下拍攝照片，并采用Image pro plus 6.0醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)對Bax及Bcl-2蛋白表達強度進行半定量分析。Bax、Bcl-2陽性反應為胞質(zhì)染成黃到棕黃顆粒和彌漫成片，陰性反應為細胞胞質(zhì)未著色。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 L929細胞的生長曲線

對3次細胞生長曲線的實驗結(jié)果進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，在L929細胞的接種濃度為(1－7)×107個/L時，細胞的增殖率與濃度呈正的直線相關(guān)(t=35.49，P＜0.05，見圖1)。根據(jù)生長曲線的實驗結(jié)果，在 MTT實驗中選取細胞的接種濃度為6×107個/L，接種于96孔板。

圖1 3次生長曲線實驗中接種細胞量與A值的關(guān)系Figure 1 Relationship between incubated cells and ODin growth curve

圖2 兩組Bax及Bcl-2蛋白的表達情況Figure 2 The expression of Bax and Bcl-2 in two groups

2.2 細胞增殖率檢測

在MTT實驗中發(fā)現(xiàn)鎳鉻合金組的細胞增殖率＞100%(見表1)，細胞毒性為0級。

表1 MTT實驗中各組細胞增殖率比較Table 1 Cell proliferation in two groups by MTT

2.3 Bax、Bcl-2 免疫組化實驗結(jié)果

采用Image pro plus 6.0醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)對Bax和Bcl-2表達強度進行半定量分析，鎳鉻合金組與陰性對照組的Bax及 Bcl-2表達情況，及 Bax/Bcl-2光密度比值見圖2(見第1003頁)，表2。鎳鉻合金組Bax的表達高于陰性對照組，兩組Bax的表達及Bax/Bcl-2的比值統(tǒng)計學差異顯著(t值分別為2.841及5.365，P＜0.05);兩組 Bcl-2 的表達無統(tǒng)計學差異(t=0.862，P＞0.05)。

表2 Bax及Bcl-2的光密度值及Bax/Bcl-2比值Table 2 OD value of Bax and Bcl-2 expression and their ratio

3 討論

近些年，國內(nèi)外學者對生物相容性的評價方法進行了大量研究，并且逐步傾向于利用現(xiàn)代分子生物學手段對生物材料的安全性進行客觀有效的評價，使評價方法從整體水平到細胞水平再深入到分子水平，希望在分子水平上建立評價材料生物相容性的標準。戴建國等［2］研究發(fā)現(xiàn)，細胞周期檢測可為生物材料的生物相容性評價提供新的思路和方法，并有望成為生物材料生物相容性評價研究的重要指標之一;洪巖松等［3］研究發(fā)現(xiàn)在時間梯度輔助下用caspase-3活化度評價4種齒科合金生物相容性，其結(jié)果與MTT法一致，可作為評價生物相容性的指標之一。從分子水平評價醫(yī)用生物材料的安全性與有效性將成為未來生物材料領域的研究重點和前沿課題［4］。

生物材料必須具備良好的生物相容性才能確保臨床應用的安全性［5］，許多生物材料的制備技術(shù)已經(jīng)相當成熟，能夠成功地應用于人體。然而，生物材料生物相容性的評價方法，仍有待進一步完善［6］。目前，關(guān)于生物材料生物相容性的評價方法主要包括體內(nèi)實驗和體外實驗。體內(nèi)實驗是在動物體內(nèi)植入生物材料，經(jīng)過一段時間后，處死動物進行組織觀察的方法。該法能夠很真實地反映材料與生物體的反應情況，對于材料的臨床應用是必要的。但是，需要對大量的動物進行長期觀察，成本較高。體外實驗法是在體外培養(yǎng)細胞，通過檢測與材料作用后的細胞變化或一些特殊物質(zhì)的產(chǎn)生與否，來反映材料的生物相容性，最常見的是通過MTT法檢測材料對細胞增殖的影響而在細胞水平上評價材料的生物相容性。本研究采用MTT實驗的方法，發(fā)現(xiàn)鎳鉻合金對L929細胞的增殖無明顯影響，鎳鉻合金的細胞毒性為0級，具有良好的生物相容性。

細胞凋亡是指由細胞基因調(diào)控的一種自主性自殺現(xiàn)象;或者說細胞凋亡是細胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，自我結(jié)束生命的死亡方式。由于這種死亡方式是由基因調(diào)控引發(fā)的，因此也被稱為程序性細胞死亡(programmed cell death)［7，8］。隨著對細胞凋亡研究的深入，發(fā)現(xiàn)線粒體凋亡通路和死亡受體凋亡通路是細胞凋亡中兩條主要的信號轉(zhuǎn)導通路［9］。Bcl-2家族蛋白的表達和調(diào)控是影響細胞凋亡線粒體通路的關(guān)鍵因素之一，在細胞凋亡線粒體信號轉(zhuǎn)導途徑中發(fā)揮重要作用。B細胞淋巴瘤/白血病基因2(Bcl-2)和Bax分別是Bcl-2家族中最具代表性的抑制凋亡和促進凋亡基因［10，11］。Bcl-2 蛋白能夠阻遏細胞凋亡，延長細胞的壽命，參與調(diào)控細胞增殖與凋亡的動態(tài)平衡，同細胞分化、成熟、組織器官的發(fā)育及腫瘤的發(fā)生有著密切的關(guān)系，Bax與Bcl-2相反，能促進線粒體促凋亡因子的釋放，誘導細胞凋亡。牙科金屬材料腐蝕析出的金屬離子及其衍生物可引起機體組織的毒性反應，并可引起細胞凋亡［12，13］。本研究發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組相比，鎳鉻合金浸提液組培養(yǎng)的小鼠成纖維細胞L929凋亡相關(guān)蛋白Bax表達增高，Bax/Bcl-2表達的比值增高，鎳鉻合金誘導小鼠成纖維細胞L929凋亡相關(guān)蛋白Bax表達增加。

本研究首先在細胞水平上通過MTT實驗發(fā)現(xiàn)鎳鉻合金的細胞毒性為0級，然后，在分子水平上通過免疫組化實驗檢測鎳鉻合金對L929細胞凋亡相關(guān)蛋白Bax及Bcl-2表達的影響，發(fā)現(xiàn)鎳鉻合金可以誘導L929細胞凋亡相關(guān)蛋白Bax表達的增高，可能通過線粒體通路誘導細胞凋亡。希望本研究結(jié)果能為將來在分子生物學水平上建立評價生物材料生物相容性的標準提供實驗依據(jù)。然而，由于凋亡機制復雜，如要進一步明確金屬離子與細胞凋亡的關(guān)系還需更深入的研究。

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